Снип на тепловые сети: СНиП 41-02-2003 Тепловые сети, СНиП от 24 июня 2003 года №41-02-2003, СП (Свод правил) от 24 июня 2003 года №124.13330.2011

Наши результаты показывают, что наблюдаемая тепловая реакция зависит как от генотипа, так и от стадии развития цветков и эмбрионов во время тепловой обработки. Картирование GWA привело к идентификации QTL, специфичных для стадии развития, и ковариация между тепловым ответом и временем цветения предполагает прямую или косвенную связь между двумя регуляторными путями. Кроме того, были идентифицированы QTL длины кремния в контрольных условиях. Гены-кандидаты были предложены для большинства QTL, некоторые из которых могут быть предварительно подтверждены путем анализа нокаут-мутантов.

ОБСУЖДЕНИЕ

За последнее десятилетие было приложено много усилий для сбора большого количества естественных вариантов для многих видов, включая модельный вид Arabidopsis. Технологический прогресс позволил детально охарактеризовать генетическое разнообразие в таких коллекциях. Ряд исследований показал использование таких плотно генотипированных природных популяций в подходах к картированию GWA (Cockram et al., 2010; Chan et al., 2011; Chao et al., 2014; Verslues et al., 2014). Такие исследования не только раскрывают большое количество естественных вариаций, присущих видам по многим признакам, но также намекают на гены-кандидаты, являющиеся причиной наблюдаемых вариаций. Последнее является важным аргументом в пользу картирования GWA по сравнению, например, с исследованиями экспрессии генов, поскольку причинные гены часто представляют собой ключевые регуляторы или важные компоненты биологических процессов, тогда как дифференциально экспрессируемые гены могут просто представлять изменения программы транскрипции в ответ на генетические или экологические возмущения.Таким образом, картирование GWA может добавить направленности в генетические регуляторные сети и идентифицировать важные опорные точки в биологических процессах. Помимо генетических нарушений, многие сложные черты могут зависеть от взаимодействия с окружающей средой и сроков развития объекта исследования, осложнение, которым часто пренебрегают. Таким образом, включение генотипического разнообразия и зависимости развития в одно исследование нарушения окружающей среды может обеспечить более глубокое понимание процессов развития, участвующих в регуляции реакций на абиотический стресс.

Определение окна чувствительности развития

В этом исследовании влияние кратковременной жары на фертильность измерялось в зависимости от стадии развития. Наблюдались большие различия в чувствительности различных стадий развития цветков и зародышей к стрессу. Раннее развитие цветков и поздний эмбриогенез, которые, как предполагается, имели место в регионах A и E, соответственно, не были чувствительны к тепловому стрессу у большинства образцов (Рисунок 3, Таблица 1). Были выявлены два минимума средней длины кремнезема, соответствующие уменьшенному завязыванию семян, что указывает на два чувствительных периода в развитии.Один из минимумов, наблюдаемых в нашем эксперименте, соответствует стадиям цветения 9, 10, 11 и 12 (Smyth et al., 1990), представляя стадии развития, на которых происходит мейоз самцов и самок и происходит удлинение пыльников (Таблица 1). Другой минимум соответствует цветкам на стадиях цветения 14 и 15, которые были подвергнуты термообработке после цветения, на этих стадиях происходит раннее формирование зародыша. Мужской мейоз, который происходит на 9 стадии цветения, является процессом, чувствительным к теплу у многих культур (Hedhly, 2011).В более раннем исследовании Arabidopsis изучалось влияние тепла на развитие цветов (но не на развитие зародыша) у образца Columbia путем подсчета плодородных стручков вдоль основного соцветия. Хотя термическая обработка в этом исследовании была более жесткой (42 ° C / 4 ч), наблюдался чувствительный период на стадии 9 цветения, как и в нашем исследовании. Кроме того, был выявлен чувствительный период на стадии цветения 12 (Kim et al., 2001). Более обширное исследование Arabidopsis, изучающее прерывание цветковых почек при тепловом стрессе у 13 естественных образцов, показало, что у образцов Columbia цветочная стадия 12, но не цветочная стадия 9, была наиболее чувствительной (Warner and Erwin, 2005). Эта цветочная стадия 9 не была идентифицирована, что могло быть вызвано более длительным периодом воздействия тепла (36 ° C в течение 72 часов). Однако было показано, что другие образцы более чувствительны, чем Columbia, и прерывание цветковых бутонов также наблюдалось на более ранних стадиях, чем стадия 12 цветков. Стадия 12 цветков соответствует удлинению пыльников. Снижение удлинения пыльников наблюдалось при тепловом стрессе в результате снижения уровня ауксина в развивающихся пыльниках. Уменьшение удлинения пыльников при тепловом стрессе также было обнаружено у других видов, таких как ячмень (Sakata et al., 2010). Наблюдения Кима и др. (2001) и Warner and Erwin (2005) согласуются с нашим наблюдением, что естественные вариации существуют как с точки зрения продолжительности окна чувствительности, так и степени уменьшения количества семян, установленных в пределах окна чувствительности. Тем не менее, сравнение стадий цветения в различных исследованиях следует проводить осторожно, поскольку соответствие между областями развития и знаковыми событиями в развитии цветков и семян основано на обобщении, и наблюдались естественные вариации количества цветков, раскрывающихся за день.

Также у других видов Brassicaceae сообщалось о тепловом отклике, аналогичном нашим наблюдениям. Исследования видов рапса и горчицы ( B. napus и B. juncea ) показали, что тепловой стресс во время цветения или развития стручков приводит к большему снижению урожайности, чем тепловой стресс во время формирования бутонов (Gan et al., 2004). Кроме того, было замечено, что стручки, прошедшие критический порог развития, были толерантны к тепловому стрессу (Angadi et al., 2000). Этот порог соответствует позднему эмбриогенезу, стадии развития, которая также не была чувствительна к теплу ни у одного образца, протестированного в нашем эксперименте. Несмотря на то, что исследование Angadi et al. (2000) подтверждают существование окна чувствительности развития, в котором тепловой стресс влияет на урожайность, сравнение этих результатов с наблюдениями в нашем эксперименте также обнаруживает интересную разницу. Мы наблюдали более сильное воздействие стресса перед цветением, в то время как у других Brassicaceae воздействие, по-видимому, более преобладающее после начала цветения. Это может быть связано с абортом эмбриона во время раннего развития кремнезема, что наблюдалось в наших экспериментах (Рисунок 1). Более того, результаты Gan et al. (2004) основаны на общем урожае семян и требуют осторожного толкования. Если механизмы компенсации активны (Рисунок 4; Angadi et al., 2003), общий урожай семян может быть не лучшим показателем для определения окна чувствительности развития.

У видов, отличных от Brassicaceae , сообщалось о тепловых реакциях, подобных нашим наблюдениям.У зеленой фасоли ( Phaseolus vulgaris ) наиболее чувствительный период был за 10 дней до цветения и мог быть связан со снижением жизнеспособности пыльцы (Suzuki et al., 2001). Это указывает на связь с мужским мейозом, что соответствует чувствительной стадии 9 цветка у Arabidopsis. У томатов бутоны цветков за 9–5 дней до цветения и цветы через 1–3 дня после цветения очень чувствительны к высоким температурам (Sugiyama et al., 1965). Эти два периода соответствуют двум минимумам, выявленным в нашем эксперименте.

Обнаружение того, что наши наблюдения за арабидопсисом согласуются с данными, собранными для тепловых реакций у различных культур, увеличивает потенциал перевода наших результатов о молекулярной регуляции теплового ответа на виды сельскохозяйственных культур. Интересно, что помимо теплового стресса засуха также влияет на развитие цветов и эмбрионов. У зерновых есть два чувствительных периода при стрессе засухи: первый сосредоточен вокруг периода мужского и женского мейоза, а второй — во время цветения и начального развития зерна (Saini, 1997).Это говорит о том, что могут быть задействованы аналогичные регуляторные механизмы, что увеличивает актуальность этой работы.

GWA-картирование выявляет специфичные для стадии QTL

Хотя в нескольких исследованиях сообщалось об окне чувствительности развития при тепловом стрессе (Kim et al., 2001; Warner and Erwin, 2005), это исследование является уникальным, поскольку оно исследует это окно чувствительности. используя большую естественную популяцию. Следовательно, данные могут быть подвергнуты картированию GWA, что позволило идентифицировать специфичные для стадии QTL.Два варианта в нашей экспериментальной установке имели решающее значение для определения QTL, специфичных для стадии. Во-первых, 1-дневная выдержка гарантировала, что развивающиеся цветы подверглись стрессу только на одной стадии развития. В экспериментах, в которых стресс применяется в течение более длительных периодов времени, идентификация специфичных для стадии QTL менее точна, потому что один цветок может испытывать стресс на нескольких стадиях развития. Во-вторых, количественная оценка воздействия теплового стресса путем измерения длины отдельных стручков вдоль основного соцветия обеспечила высокое разрешение тепловых эффектов, связанных с развитием.Исследования, которые количественно оценивают реакцию на тепловой стресс по общему урожаю семян или фруктов, будут иметь меньше возможностей для выявления эффектов, которые присутствуют только в небольшом окне развития. Механизмы компенсации растений (Рисунок 4; Angadi et al., 2003; Young et al., 2004) делают общий урожай семян или плодов еще менее надежным. Наши результаты должны повысить осведомленность о том факте, что регуляция интересующей черты может изменяться в процессе развития. Дизайн экспериментов является здесь решающим фактором, который в большинстве случаев определяет, можно ли обнаружить специфичность стадии развития QTL или регуляторных сетей или нет.Точные измерения или большие размеры популяции не будут способствовать более высокой степени обнаружения QTL, специфичных для стадии, когда выбран неоптимальный дизайн.

В нашем исследовании основное внимание уделялось идентификации специфичных для стадии QTL. Два минимума были идентифицированы в длине кремнезема после теплового стресса, соответствующие двум отдельным процессам в развитии цветов и семян (Рисунок 3, Таблица 1). Информация по этапам может быть полезна для определения приоритетов генов-кандидатов для будущих функциональных анализов. Гены, которые не экспрессируются на стадии развития, на которой идентифицирован QTL, или которые не экспрессируются в цветках или эмбрионах, могут иметь более низкий приоритет. В этом исследовании четыре QTL были идентифицированы как сильно связанные с тепловым ответом: один специфичный для ответа после цветения и три специфических для ответа до цветения. Основываясь на LD, аннотированной функции гена, профилях экспрессии и анализе мутантов, один или два гена на QTL могут быть приоритетными в качестве генов-кандидатов. Нокаут-анализ нескольких генов-кандидатов показал участие этих генов в ответах репродуктивных процессов на тепловой стресс.Однако для ряда генов их участие не удалось подтвердить. Это может быть связано с генетическим фоном мутантной линии (Col-0), дикий тип которой используется для сравнения. С другой стороны, нокауты, которые действительно показывают значительное влияние на изучаемый признак, не исключают окончательно участие других генов, объясняющих наблюдаемые вариации в окне поддержки QTL. Дальнейшие доказательства должны быть получены из исследований функциональной комплементации в различных генетических фонах.

Во многих исследованиях, описывающих тепловой стресс во время цветения, видная роль отводится белкам теплового шока (Hsps) и факторам транскрипции теплового шока (Hsfs) (Giorno et al., 2013). Напр., Конститутивное и вызванное тепловым стрессом накопление Hsps в репродуктивной ткани (особенно в пыльниках) связано с термостойкостью (Bita et al., 2011). Hsps стабилизируют белки, которые разворачиваются из-за теплового стресса (Al-Whaibi, 2011). Hsps, как шапероны, предотвращают необратимую агрегацию других белков и участвуют в рефолдинге белков в условиях теплового стресса (Waters, 2013).Удивительно, но в нашем исследовании не было обнаружено Hsp или Hsf в непосредственной близости от QTL (порог –log (P) = 5,5), и только два Hsps были идентифицированы в пределах 20 т.п.н. от умеренно ассоциированных SNP (пороговое значение –log (P) = 4), предполагая, что аллельные вариации Hsps или Hsfs не являются основной причиной естественных вариаций термостойкости во время цветения. Отсутствие этих очевидных кандидатов в наших результатах показывает, что нецелевой анализ, такой как картирование GWA, во многих случаях приводит к идентификации новых функций генов, в то время как исследования, основанные на гипотезах, в большинстве случаев приводят к доказательству или опровержению. уже предложенной функции.

Генетическая регуляция теплового ответа и цветения

Высокая отрицательная корреляция и совпадение сильно (таблица 4) и умеренно связанных SNP (дополнительный набор данных 2) наблюдались для устойчивости к тепловому стрессу и времени цветения. QTL6 был определен для реакции на тепловой стресс, но также умеренно связан со временем цветения. Значимый SNP QTL6 был связан с SNP в FLC , репрессоре времени цветения, и его промоторе. Влияние теплового стресса оценивалось на двух изогенных линиях: одна с функциональным аллелем FLC , требующая яровизации для цветения, и вторая, содержащая нулевой аллель FLC , приводящая к раннему цветению. Тепловой стресс привел к значительному сокращению длины стручка в позднецветущей линии по сравнению с раннецветущей. Анализ шести наиболее распространенных гаплотипов FLC дополнительно подтвердил, что тепловая чувствительность связана с поздним цветением и может быть основана на перекрестных помехах между регулирующими сетями. Несмотря на то, что изменение реакции на тепловой стресс сопоставлено с FLC , мы не можем исключить косвенное влияние разницы во времени цветения. Особенно потому, что экспрессия FLC снижается в течение 10 недель яровизации, серьезно снижая вариабельность экспрессии FLC во время лечения (Michaels and Amasino, 1999; Shindo et al., 2006). Хотя другие известные генетические факторы, влияющие на время цветения, также могут косвенно способствовать изменению реакции на тепловой стресс, анализ этой взаимосвязи выходит за рамки данного исследования. Положительная корреляция была также обнаружена для устойчивости к холоду и времени цветения у сои, где высокая устойчивость была связана с поздним цветением (Kurosaki et al. , 2004). Было показано, что различия в толерантности связаны с естественными вариациями в хорошо известном локусе созревания. Хотя реакция на неоптимальные температуры может быть связана с естественным изменением времени цветения или генов созревания, мы не можем исключить, что корреляция, обнаруженная в нашем эксперименте, была вызвана холодным грунтованием.Время между холодным периодом, необходимым для синхронизации цветения, и обработкой не одинаково для всех образцов: образцы, которые зацвели раньше, по сути, получали обработку раньше после обработки холодом, чем позже цветущие. Возможно, растения, недавно обработанные холодной грунтовкой, менее чувствительны к тепловому стрессу. Это грунтовка может высвобождаться со временем, что со временем приводит к повышенной чувствительности к тепловому стрессу. Однако для образцов, подвергшихся термообработке в тот же день после обработки холодом, наблюдалась естественная изменчивость, что указывает на то, что большая часть естественной изменчивости не может быть объяснена различиями в периоде между холодной и термической обработкой. Таким образом, мы предполагаем, что различия в термостойкости, наблюдаемые между ранними и позднецветущими образцами, являются результатом местной адаптации. Раннецветущие образцы — это летние однолетние растения, которые прорастают весной и цветут летом, тогда как позднецветущие образцы — это зимние однолетние растения, которые прорастают осенью, переживают зиму на вегетативной стадии и цветут весной. Это говорит о том, что раноцветущие образцы выиграют от механизма термостойкости своих цветов, тогда как позднецветущие — нет, потому что цветы редко будут подвергаться воздействию высоких температур весной.

Гомология реакций на тепловой стресс между видами

Как уже упоминалось, у нескольких видов сельскохозяйственных культур наблюдаются сходные стадийно-специфические тепловые реакции, что предполагает общие регуляторные механизмы реакции растений на повышенную температуру во время цветения, а также на завязывание плодов и семян. Такой общий ответный механизм является многообещающим для трансляции результатов от модельных видов к сельскохозяйственным культурам. К сожалению, сравнение QTL, наблюдаемых в этом исследовании, с ранее идентифицированными QTL в других исследованиях по картированию сельскохозяйственных культур, направленных на идентификацию генов термостойкости во время цветения, затруднено, поскольку большинство QTL еще не были клонированы (Grilli et al., 2007; Ye et al., 2012; Лукас и др., 2013). Все более ранние исследования проводились на популяции двух родителей с низким разрешением; поэтому связанные области все еще содержат много генов. Поскольку ни одна из протестированных культур (рис, томат и вейный горох) близко не родственна Arabidopsis, сравнение участков генома затруднено из-за отсутствия синтении. Однако из-за высокого разрешения картирования GWA и огромного количества предварительной информации, доступной по Arabidopsis, многообещающе проследить за приоритетными генами-кандидатами, идентифицированными в этом исследовании, с дальнейшим функциональным анализом, чтобы идентифицировать их функции и впоследствии иметь возможность идентифицировать тепловая сеть. Трансляция сети ответов от одного вида к другому может быть более плодотворной, чем сравнение отдельных генов (Ferrier et al., 2011). Гомологи белков в этом пути могут быть идентифицированы, а знания о функции и экспрессии белков, взаимодействиях белок-белок и взаимодействиях белок-метаболит могут быть использованы для идентификации аналогичного пути ответа у других видов (Assmann, 2013).

Хотя в данной статье основное внимание уделяется длине кремнезема у растений, подвергшихся тепловому стрессу, результаты, полученные от растений, выращенных в контрольных условиях, также актуальны для целей селекции.Для повышения урожайности и, следовательно, получения большего количества масла, интенсивно ведется селекция сортов B. napus и B. juncea . Общий урожай определяется несколькими характеристиками растения, такими как общее количество плодов на растение, масса семян, количество семян на плод и длина плодов. Последние три коррелированы, и сообщалось о многих совпадающих QTL (Alonso-Blanco et al., 1999; Dechaine et al., 2014; N. Li et al., 2014). Длина плода считается подходящим признаком для выбора в B.napus (Samizadeh et al., 2010), поскольку по этому признаку наблюдается высокая наследуемость, которая менее чувствительна к GxE, чем, например, общее количество плодов на растении (Chay, Thurling, 1989; Dechaine et al., 2014 ). В этом эксперименте высокая наследуемость наблюдалась также по длине кремния (таблица 3). Поскольку Arabidopsis является членом семейства Brassicaceae , аналогичные механизмы, вероятно, будут определять длину стручка, и перенос результатов картирования с этого модельного вида на культуры должен быть относительно простым.

Три гена-кандидата были идентифицированы по длине силикатной оболочки в контрольных условиях, и все они содержали домен аллергена пыльцы. Известно, что аллергены на пыльцу вызывают у людей аллергические реакции, поэтому они интенсивно изучаются. Хотя их биологическая функция у растений еще полностью не выяснена (Jiménez-López et al., 2011), предполагается, что эти белки могут ослаблять клеточную стенку материнской ткани, чтобы облегчить проникновение пыльцевой трубки в рыльце (Cosgrove и другие., 1997; Mollet et al., 2013). На томатах были проведены эксперименты по конкуренции между пыльцой дикого типа и пыльцой, в которой один из этих аллергенов пыльцы был мутирован. Было обнаружено, что пыльца с мутировавшим белком уступает место пыльце дикого типа из-за более медленного роста пыльцевых трубок, что указывает на важную роль пыльцевых аллергенов в доступе пыльцы к яйцеклетке (Valdivia et al., 2007). Длина кремнезема коррелирует с количеством семян на кремнезем (рис. 1). Более медленное проникновение в пыльцевую трубку может привести к менее эффективному оплодотворению; как следствие, разовьется меньше семян и стерни будут короче.По клиническим иммунологическим причинам вариабельность этих аллергенов изучается между видами и внутри видов (Radauer and Breiteneder, 2006; Songnuan, 2013), но влияние естественных вариаций на успех оплодотворения еще не изучено.

В заключение, выбранный экспериментальный дизайн был очень подходящим для определения генетических регуляторов теплового ответа репродуктивных процессов, специфичных для стадии развития. Предварительная проверка нокаут-анализом была предоставлена ​​для двух предварительных QTL, что усилило кандидатуру двух генов в непосредственной близости от значительно ассоциированных SNP.Кроме того, высокое разрешение картирования GWA, сходство между развитием цветов и семян у разных видов, а также предполагаемые общие регуляторные механизмы теплового ответа делают перевод результатов, полученных на арабидопсисе, на культуры многообещающими. Для достижения этой цели необходимы дальнейшие функциональные анализы генов-кандидатов у Arabidopsis и их гомологов в сельскохозяйственных культурах.

МЕТОДЫ

Растительный материал

Коллекция, состоящая из 285 природных образцов Arabidopsis thaliana (дополнительный набор данных 1), отобранных для отражения большей части генетических вариаций, присутствующих внутри вида (Platt et al., 2010) и генотипированный по ~ 215 тыс. Маркеров SNP (Affymetrix SNP-tilling array Atsnptile1; Atwell et al., 2010; Li et al., 2010) был получен из ABRC Stock Center (Baxter et al., 2010).

Для функционального генного анализа две линии, FRI-sf2 и FRI-flc3 , содержащие два разных аллеля FLC на фоне Колумбии (Michaels and Amasino, 1999), были любезно предоставлены M. Koornneef ( MPI Köln). FRI-sf2 (CS6209) также можно получить на складе ABRC.Кроме того, следующие мутанты по вставке Т-ДНК SALK (Alonso et al., 2003) и мутанты по вставке Т-ДНК GABI-Kat (Kleinboelting et al., 2012) были получены из NASC: qul2-2 (SALK_065604c), AT2G03505 (GABI_745A07), AT2G03490 (SALK_125910), mips3-2 (SALK_120131c; Донахью и др., 2010) и AT5G10200 (SALcK_0409). Семена мутантов qul1-1 и qul1-1 qul2-1 любезно предоставлены Л. Остергаардом (Fuentes et al., 2010). Растения, несущие вставку гомозиготной Т-ДНК, генотипировали с помощью ПЦР с использованием праймеров, перечисленных в дополнительной таблице 1.

Экспериментальная установка

Для каждого образца восемь растений выращивали в контролируемых условиях. Пять повторов подвергались термической обработке, а три повтора служили контролем. Семена высевали в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу. После 4 дней обработки холодом их помещали на свет при комнатной температуре на полтора дня для прорастания. Проросшие семена помещали на блоки из минеральной ваты, насыщенные питательным раствором (Hyponex, 1 мМ N, 1.1 мМ P и 5,9 мМ K) в климатической комнате (16 часов света, 125 мкмоль / с / м ² , влажность 70%, 20/18 ° C). Три раза в неделю блоки минеральной ваты пропитывались питательным раствором с помощью автоматической системы затопления. Через 3 недели растения яровировали в течение 10 недель для синхронизации цветения. После яровизации растения возвращали в климатическую комнату (условия, указанные выше). Через одну-две недели после того, как первая реплика образца начала цвести, ко всем репликам этого образца была применена термообработка.Небольшое количество образцов подверглось обработке за пределами этого окна из-за большой разницы во времени цветения между повторностями (дополнительный набор данных 1). Первый распустившийся в день обработки цветок был помечен ниткой. Три реплики на образец хранились в климатической комнате в качестве контрольных. По пять экземпляров каждого образца переносили в климатический шкаф, где они подвергались термообработке. В начале дня температура повышалась с 20 до 35 ° С за 2 ч.Температуру поддерживали при 35 ° C в течение 13,5 ч. По окончании светового периода снова понижали температуру до 20 ° С на 2 ч. На следующий день после обработки растения возвращали в климатическую комнату.

Эту же процедуру использовали для проверки теплового отклика в FRI-sf2 и FRI-flc3. Для других мутантов со вставкой Т-ДНК, использованных в этом исследовании, была использована та же процедура, но без периода яровизации. Все линии были протестированы в двух независимых экспериментах (эксперименты A и B).

Сбор и анализ основных соцветий Siliques

Когда растение перестало давать новые цветы или когда по крайней мере 40 цветков над меткой нитки превратились в стручки, основное соцветие было отрезано и сохранено в бумажном пакете для последующего анализа.Контрольные и обработанные растения одного и того же образца всегда собирали в один и тот же день. Сохраненный материал использовали для определения длины всех стручков, присутствующих в основном соцветии. Кремний, помеченный нитью, был помечен как позиция номер 0. Siliques под тегом получил отрицательные номера позиций, а Siliques над тегом получил положительные номера позиций (рис. 2).

Свойства семян

Чтобы определить количество семян на кремневую стружку и их размер, семена были распределены на белой бумаге, и фотографии были сделаны в условиях постоянного освещения, чтобы облегчить обработку изображений.Снимки обрабатывались с помощью программного пакета ImageJ (Schneider et al., 2012). На основе распределения по размеру темно-коричневых и светло-коричневых семян порог 0,12 мм ² был использован для определения семян малого и нормального размера, что указывает на нежизнеспособные и жизнеспособные семена, соответственно. Для определения всхожести семена помещали на влажную фильтровальную бумагу в чашки Петри, запечатанные Parafilm. Чашки Петри помещали в темноту при 4 ° C на 4 дня. После этого чашки Петри помещали на свет при комнатной температуре.Подсчет количества проросших и непрорастающих семян проводили через 48 ч на свету.

Анализ экспрессии QUL1 и QUL2

Экспрессия QUL1 и QUL2 была измерена в мутантах qul1-1 , qul2-2 и qul1-1 qul2-1 , а также в мутантах Col- 0 у 3-недельных растений, выращенных при 22 ° C в течение 16 часов света. РНК выделяли из 20-100 мг розетки растений с помощью набора Invitrap Spin Plant RNA Mini (Strateco) в соответствии с инструкциями производителя.Для синтеза кДНК 1 мкг РНК был преобразован в кДНК с использованием набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad) в соответствии с инструкциями производителя. Затем кДНК разбавляли до конечного объема 150 мкл для использования в RT-qPCR. Отсутствие геномной ДНК подтверждали сравнением образцов кДНК с образцами РНК, которые не подвергались обратной транскрипции (минус контроль RT). RT-qPCR выполняли на CFX-Connect (Bio-Rad) в 96-луночных планшетах (HSP-9645; Bio-Rad), используя на лунку общий объем 10 мкл, состоящий из 2х.5 мкл кДНК, 0,5 мкл 10 мкМ смеси праймеров, 5 мкл iQ SYBR Green (Bio-Rad) и 2 мкл воды. Для каждой реакции использовалась следующая программа: 95 ° C в течение 3 минут, затем 40 циклов при 95 ° C в течение 15 секунд и 60 ° C в течение 30 секунд с последующим анализом кривой плавления от 65 до 95 ° C. Каждую из четырех биологических повторностей измеряли в двух экземплярах. Экспрессию QUL1 и QUL2 измеряли с использованием праймеров, описанных Fuentes et al. (2010). Для эталонного гена MONENSIN SENSITIVITY1 ( MON1 ; AT2G28390 ) набор праймеров, описанный Chechowski et al.(2005). Данные экспрессии нормализовали с помощью метода 2 ^{-ΔΔ C T} (Schmittgen and Livak, 2008).

Статистический анализ

GWA-картирование было выполнено на основе плодородия и архитектурных особенностей, а также времени цветения. GENSTAT (VSN International, 2013) был использован для расчета простых остатков, которые характеризуют воздействие тепла, с поправкой на разницу между образцами в размере силикатов в контрольных условиях.Простые остатки были рассчитаны для средней длины кремнезема в различных участках соцветия, представляющих разные стадии развития. Для расчета простых остатков среднее значение данных, собранных в условиях контроля и теплового стресса, сравнивали с помощью линейной регрессии (наименьшая сумма квадратов), включая все образцы. Картирование GWA было выполнено с помощью программного пакета EmmaX (Kang et al., 2010). Использовалась смешанная модель с поправкой на структуру популяции на основе матрицы родства всех SNP.SNP с частотой минорного аллеля ниже 0,05 были исключены из анализа. Для каждого SNP было рассчитано, какая часть общей фенотипической и генотипической дисперсии может быть объяснена аллелями этого SNP. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена (ρ) (двусторонний, α = 0,05) использовался для определения корреляций между рядами данных с помощью SPSS (версия 19.0; IBM Corp.). Односторонний двухвыборочный тест t , предполагающий неравные отклонения, использовался для сравнения среднего числа цветков, образовавшихся на основном соцветии у контрольных и термически обработанных растений.ANOVA и анализ ковариации были использованы для сравнения фенотипических средних для каждого из гаплотипов FLC (P. Li et al., 2014) (дополнительный набор данных 4). Первые 10 основных компонентов матрицы родства использовались в качестве ковариат. Последующие попарные сравнения были выполнены с использованием поправки Бонферрони.

Все последовательности из повторно секвенированных образцов Arabidopsis были получены из 1001genomes.org для 525 образцов, и были загружены файлы 2012 нуклеотидных вариаций по сравнению с Col-0 (TAIR10).Пользовательские сценарии Perl были разработаны для определения позиций с частотой аллелей> 2% (SNP должны быть общими для более чем 11 образцов). Другой сценарий Perl анализирует эти позиции для каждого доступа и выводит либо 1, либо 0 для соответствия или несоответствия Col-0. Полученные данные сохраняются в виде фреймов данных (.csv) на диске. Чтобы вычислить LD, необходимые данные были извлечены из файлов .scv с помощью программы gnu «cut», чтобы вырезать интересующую область. Срезанный кадр данных считывается в R (R Development Core Team, 2012), и по столбцам LD ( r ² или коэффициент корреляции) может быть определен путем вызова функции R «cor ()» с последующим квадратичным операция.Результаты LD доступны пользователю через веб-интерфейс (только для внутреннего доступа). Пользователь может рассчитать LD в любой области генома.

Номера доступа

Данные о последовательностях из этой статьи можно найти в базах данных Arabidopsis Genome Initiative или GenBank / EMBL под следующими номерами доступа: AT1G13860, AT1G56510, AT1G56580, AT1G56590, AT1G78240, AT2G03G0390, AT2G03490, AT2G034905 AT3G45970, AT3G48190, AT3G48210, AT4G00650, AT4G19710, AT5G10140, AT5G10170, AT5G10200, AT5G10200, AT5G22430 и AT5G22640.

Дополнительные данные

• Дополнительный рисунок 1. LD между значимыми SNP, обнаруженными с помощью сопоставления GWA, и окружающими SNP, полученными из данных повторной последовательности.

• Дополнительная фигура 2. Экспрессия QUL1 и QUL2 в одинарных и двойных мутантах и ​​Col-0 дикого типа.

• Дополнительная таблица 1. Праймеры левой и правой границы, используемые для определения гомозиготности вставок Т-ДНК.

• Дополнительный набор данных 1. Даты начала цветения первого экземпляра образца и даты, когда образцы подвергались термообработке.

• Дополнительный набор данных 2. SNP, идентифицированных картированием GWA для времени цветения и средней длины кремния в областях развития B, C и D (как определено на рисунке 2) в контрольных условиях и условиях термообработки и их соответствующих остатков. для этих регионов.

• Набор дополнительных данных 3. Silique — длина вдоль соцветия подвергшихся тепловому стрессу и контрольных растений нескольких линий вставки Т-ДНК и двух линий с функциональными (FRI-sf2) и нефункциональными (FRI-flc3) аллелями FLC.

• Дополнительный набор данных 4. Средняя длина стебля в регионах B, C и D и время цветения для образцов шести наиболее распространенных аллелей FLC (P. Li et al., 2014).

Сетевое функциональное прогнозирование увеличивает генетическую ассоциацию для прогнозирования генов-кандидатов для гиперчувствительности к гистамину у мышей | G3: Гены | Геномы

Abstract

Генетическое картирование — это основной инструмент генетики модельных организмов; однако многие локусы количественных признаков (QTL) содержат десятки или сотни позиционных генов-кандидатов.Приоритет этих генов для проверки часто составляет ad hoc и смещен предыдущими выводами. Здесь мы представляем метод определения приоритетности позиционных кандидатов на основе вычисленной функции гена. В нашем методе используется машинное обучение с функциональными геномными сетями, связи которых кодируют функциональные ассоциации между генами, для выявления сетевых сигнатур функциональной ассоциации с интересующим признаком. Мы демонстрируем метод путем функционального ранжирования позиционных кандидатов в большом локусе на мышах Chr 6 (45.От 9 МБ до 127,8 МБ), связанных с гиперчувствительностью к гистамину (Histh). Histh характеризуется системным истечением сосудов и отеком в ответ на введение гистамина, что может привести к полиорганной недостаточности и смерти. Хотя на риск Histh сильно влияет генетика, мало что известно о его основных молекулярных или генетических причинах из-за генетической и физиологической сложности признака. Чтобы проанализировать эту сложность, мы ранжировали гены в локусе Histh , предсказывая функциональную ассоциацию с множественными процессами, связанными с Histh.Мы объединили эти прогнозы с новыми данными ассоциации однонуклеотидного полиморфизма (SNP), полученными из обзора 23 инбредных линий мышей и данных конгенного картирования. Лучшие гены включали Cxcl12 , Ret , Cacna1c и Cntn3 , все из которых имели сильные функциональные ассоциации и были проксимальнее SNP, расщепляющихся с Histh. Эти результаты демонстрируют возможности сетевых вычислительных методов для определения весьма правдоподобных количественных генов признаков даже в сложных случаях, включающих большой QTL и крайнюю сложность признака.

Идентификация причинных вариантов в локусах количественных признаков (QTL) является центральной проблемой генетики, но генетическое сцепление часто предотвращает сужение QTL до уровня менее нескольких мегабаз (Mb). Таким образом, QTL может содержать сотни генов-кандидатов. Вместо того, чтобы выявить точный ген (или гены), ответственный за вариацию признаков, картирование QTL дает позиционные гены-кандидаты. Строгое сужение QTL путем точного картирования с конгенными штаммами может занять годы или десятилетия, особенно у таких организмов, как мыши, у которых долгое время генерации.Более того, конгенное картирование с высоким разрешением часто показывает, что общий эффект QTL обусловлен множественными сцепленными генами внутри QTL, а не одним геном (Parker et al. 2013; Yazbek et al. 2011). Таким образом, одних только позиционных данных обычно недостаточно, чтобы выдвинуть кандидатуры генов для последующего биологического наблюдения. Чтобы преодолеть ограничения картографических данных, исследователи ищут в QTL вероятные гены-кандидаты. Однако этот отбор обычно осуществляется по специальным критериям с использованием предварительных знаний или литературного поиска.Эта стратегия сильно ориентирована на предварительные знания и очень подвержена ошибкам из-за отсутствия аннотаций. Необходимы строгие и систематические стратегии для различения позиционных генов-кандидатов для механистического наблюдения.

Мы разработали новый подход к ранжированию кандидатов на должность, основанный на функциональной ассоциации с характеристикой. Чтобы избежать аннотаций или предвзятости в литературе, мы используем функциональные геномные сети (FGN), которые кодируют предсказанные функциональные ассоциации между всеми генами в геноме.FGN, такие как Функциональные сети тканей мыши (FNTM) (Goya et al. 2015) и HumanBase (Greene et al. 2015), представляют собой байесовские интеграционные сети, которые объединяют коэкспрессию генов и данные связывания белок-белок. , аннотации онтологии и другие данные для прогнозирования функциональных ассоциаций между генами. С помощью этих сетей мы можем расширить известные ассоциации генов и признаков, чтобы идентифицировать гены, которые ранее не были связаны с этим признаком.

Недавние исследования функциональных геномных сетей продемонстрировали их способность генерировать новые ассоциации между генами и определенными терминами фенотипа (Guan et al. 2010) или биологические процессы (Ju et al. 2013). Например, Guan et al. (2010) использовал классификатор машины опорных векторов (SVM) для идентификации генной сети, связанной с минерализацией костей. Они предсказали и подтвердили новые ассоциации между генами и фенотипами минерализации костей для генов, лежащих за пределами всех опубликованных QTL фенотипов минерализации костей (Guan et al. 2010). Последующие исследования с использованием аналогичных сетевых методов сделали новые прогнозы генов, связанных с гипертонией и аутизмом (Greene et al. 2015; Кришнан и др. 2016). Мы расширили эти методы, чтобы ранжировать гены в картированном QTL на основе множества предполагаемых функциональных терминов и интегрировать эти ранжирования со значениями генетической ассоциации p из исследований штаммов. Мы создали ранжированный список для всех генов в QTL, который включал как функциональные, так и позиционные баллы каждого гена-кандидата.

Наша стратегия сначала построила списки генов, ассоциированных с признаками, из структурированных биологических онтологий ( e.грамм. , Онтология генов (Ashburner et al. 2000; Gene Ontology Consortium 2018) и Онтология фенотипа млекопитающих (Smith and Eppig 2012)) и общедоступные транскриптомные данные из Gene Expression Omnibus (GEO) (Эдгар и др. 2002; Barrett et al. 2012). Затем мы применили классификаторы машинного обучения к функциональным сетям тканей у мышей (FNTM) (Goya et al. 2015), чтобы определить сетевые сигнатуры списков генов, связанных с признаками. Эта стратегия позволила нам предсказать ассоциации ген-признак, которые не были аннотированы в рамках структурированной онтологии, преодолев проблему отсутствия аннотации.

Мы применили наш подход к большому QTL, связанному с гиперчувствительностью к гистамину (Histh) у мышей. Histh у мышей — это летальная реакция на инъекцию гистамина. У нечувствительных мышей инъекция гистамина вызывает воспалительную реакцию, которая проходит без дальнейшего лечения. У мышей с ответом Histh развивается возбуждение и побледнение ушей, за которыми следует прогрессирующий респираторный дистресс, вазодилатация, анафилактический шок и смерть (Vaz et al. 1977; Wang et al. 2014).Histh можно индуцировать в подгруппе линий мышей путем сенсибилизации полным адъювантом Фрейнда (CFA). Histh также развивается спонтанно у животных SJL / J старше шести месяцев.

Ранее мы сопоставили Histh с локусом на Chr 6 (от 45,9 МБ до 127,8 МБ; локус Histh ), что было подтверждено с использованием конгенной линии (B10.S- Histh ^SJL ) (Raza et al. в печати). Из-за большого размера этого локуса требуется дополнительная информация для выявления причинных вариантов.Чтобы сузить круг кандидатов, мы интегрировали новые данные генетической ассоциации из интервала-специфичных конгенных рекомбинантных линий (ISCRL) и обзор инбредных штаммов с нашими сетевыми функциональными предсказаниями генов, связанных с Histh. Дополнив позиционные данные функциональными прогнозами, мы резко сократили список генов-кандидатов до управляемого набора высококачественных кандидатов, которые участвуют в процессах, связанных с Histh.

Материалы и методы

В качестве дополнения к вычислительной части раздела о методах этот документ включает исполняемый рабочий процесс (см. Доступность данных).Схема вычислительного рабочего процесса показана на рисунке 1. Рабочий процесс включает в себя все файлы и параметры, необходимые для воссоздания вычислительных частей этого исследования.

Обзор рабочего процесса. Рабочий процесс разбит на блоки по цвету, каждый с заголовком, выделенным жирным шрифтом. Каждый блок показывает, как данные (синие прямоугольники) обрабатывались (серые прямоугольники) для достижения результатов (зеленые прямоугольники). Стрелки показывают общий поток работы и зависимость (и независимость) отдельных анализов.

Животные

Всего 23 линии мышей (129X1 / SvJ, A / J, AKR / J, B10.S- H 2s / SgMcdJ (B10.S), BALB / cJ, BPL / 1J, BPN / 3J, C3H / HeJ, C57BL / 6J, C57BL / 10J, CBA / J, CZECHII / EiJ, DBA / 1J, DBA / 2J, FVB / NJ, JF1 / MsJ, MOLF / EiJ, MRL / MpJ, NOD / ShiLtJ, NU / J, PWD / PhJ, PWK / PhJ, SJL / J и SWR / J были приобретены в лаборатории Джексона ( Бар-Харбор, Мэн). Все мыши, в том числе линии B10.S- Histh ^SJL и B10.S- Histh ^SJL ISRC, были созданы и содержались в определенных свободных от патогенов условиях в виварии данного медицинского корпуса. в Университете Вермонта в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения.Все исследования на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Вермонта.

Histh Фенотипирование

В день 0 мышам вводили 2 подкожно. сайты с полным адъювантом Фрейнда (CFA) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) с добавлением 200 мкг г Mycobacterium tuberculosis h47Ra (Difco Laboratories, Детройт, Мичиган). На 30 день определяли гиперчувствительность к гистамину внутривенно. инъекция гистамина (мг / кг сухого веса свободного основания) в фосфатно-солевом буфере (PBS).Смерти регистрировали через 30 минут после инъекции, и данные представляли как количество погибших животных по отношению к количеству исследованных животных. Достоверность наблюдаемых различий определяли по критерию хи-квадрат со значениями p <0,05 достоверно.

Экстракция ДНК и генотипирование

ДНК выделяли из отрезков хвоста мыши, как описано ранее (Sudweeks et al. 1993). Вкратце, отдельные кусочки хвоста инкубировали с буфером для лизиса L-клеток (мкг / мл протеиназы K, 100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8.3), 10 мМ EDTA, 100 мМ KCl, 0,50% SDS) в течение ночи при температуре. На следующий день добавляли мкл 6 М NaCl с последующим центрифугированием в течение 10 мин при. Слой супернатанта переносили в свежую пробирку, содержащую 1 л изопропанола. После центрифугирования в течение двух минут супернатант удаляли, а осадок промывали 70% этанолом. После последнего двухминутного центрифугирования супернатант удаляли, а ДНК сушили на воздухе и ресуспендировали в L TE.

Генотипирование:

Генотипирование выполняли с использованием микросателлитных маркеров в стандартной реакции ПЦР или специфичных для последовательности праймеров SNP в реакции фототипирования.Полиморфные микросателлиты были выбраны так, чтобы иметь минимальный полиморфизм 8 пар оснований для оптимальной идентификации с помощью электрофореза в агарозном геле. Вкратце, праймеры синтезировали с помощью IDT-ДНК (Коралвилл, ИА) и разбавляли до концентрации М. ПЦР-амплификацию выполняли с использованием Promega GoTaq. Условия цикла включали двухминутный этап начальной денатурации при 94 °, за которым следовали 35 циклов при 94 ° в течение 30 секунд, 55 ° в течение 30 секунд и 72 ° в течение 30 секунд, а затем заключительный этап удлинения при 72 ° в течение пяти минут.Ампликоны подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле и визуализировали бромидом этидия и УФ-светом.

Фототипирование:

Генотипирование выполняли с использованием специфичных для последовательности праймеров, которые различаются только 3 ’нуклеотидом, соответствующим каждому аллелю идентифицированного SNP (Bunce et al. 1995). Каждый набор праймеров был разработан с использованием Primer3 с Tm 58-60 ° C, синтезирован с помощью IDT-DNA (Коралвилл, штат Айяо) и использован в концентрации 100 мк M (последовательности праймеров доступны в дополнительном файле 1). .Реакции ПЦР подвергались многостадийным (высокая, средняя и низкая строгость) циклическим условиям, как описано в дополнительном файле 2, и, если было обнаружено, что это необходимо, условия цикла на каждой стадии корректировались для обеспечения оптимальной температуры отжига. Ампликоны подвергали электрофорезу с загрузочным буфером L Orange G на 1,5% агарозном геле, окрашенном бромидом этидия и визуализированном в УФ-свете. Присутствие SNP-специфического аллеля оценивали путем наблюдения ампликона ожидаемого размера в любой реакции.Условия цикла доступны в дополнительном файле 2.

Генерация конгенных линий Histh и GigaMUGA

B10.S- Histh ^SJL Линии ISRC были созданы путем идентификации рекомбинантных гаплотипов в интервале Histh среди (B10.S- Histh ^SJL × B10.S) × B10.S BC1, а затем фиксировали в виде гомозиготных линий (рис. 3). Для выявления потенциальных контаминирующих фоновых локусов, сегрегированных среди штаммов, и для дальнейшего уточнения точек разрыва рекомбинации для каждой линии, линии были дополнительно генотипированы с использованием массивов GigaMUGA (143 259 маркеров) коммерческой службой Neogen / Geneseek (Lincoln, NE).

Целевое генетическое ассоциативное тестирование

Мы извлекли данные о генотипах (как кодирующих, так и некодирующих) 23 линий мышей из баз данных Института Сэнгера (Keane et al. 2011) (https: //www.sanger. ac.uk/science/data/mouse-genomes-project) и Лаборатория Джексона (Bogue et al. 2017) (https://phenome.jax.org/). Отсутствие представительства штаммов дикого происхождения , например. , MOLF / EiJ и др. В этих базах данных было компенсировано генотипированием с использованием платформы Illumina Hiseq 2500 https: // www.illumina.com/. Подробные методы см. В дополнительном файле 3. Все эти источники данных были сопоставлены для получения информации о генотипе в общей сложности 15 302 SNP по локусу Histh (45-128 Мбит / с, дополнительный файл 4).

Для расчета ассоциаций между генетическим полиморфизмом и Histh мы использовали эффективную ассоциацию смешанных моделей (EMMA) (Kang et al. 2008). Этот метод рассматривает генетическое родство как случайную величину в линейной смешанной модели для учета структуры популяции, тем самым уменьшая ложные ассоциации между SNP и измеряемым признаком.Для расчета матрицы родства мы составили набор из 470 365 SNP для всех штаммов из базы данных Mouse Genome Informatics (веб-сайт Mouse Genome Informatics Mouse Genome Informatics). Мы удалили SNP в конгеническом интервале из оценки родства и сгенерировали матрицу родства с оставшимися 455 068 SNP. Мы использовали тестовую функцию отношения правдоподобия (emma.ML.LRT) для получения p значений. Значимость определялась поправкой Бонферрони (). Геномные координаты включены для каждого SNP с использованием последней сборки генома мыши GRCm38.p5 / мм10.

Наборы генов, связанных с признаками

Позиционные гены-кандидаты были ранжированы на основе их предсказанной ассоциации с семью функциональными терминами, относящимися к фенотипу Histh: «старение», « Mycobacterium tuberculosis », «сердечная», «связанная с G-белком. рецептор »,« гистамин »,« воспаление »,« гиперчувствительность I типа »и« проницаемость сосудов ». Мы использовали Джина Уивера (Baker et al. 2012) для создания наборов генов, связанных с каждым термином. Для этого мы ввели каждый термин на главную страницу Gene Weaver (https: // geneweaver.org). Мы ограничили поиск генами человека, крысы и мыши и только тщательно подобранными списками. Ортологи мыши для каждого гена были получены с помощью инструмента пакетного запроса в MGI (http://www.informatics.jax.org/batch_data.shtml). Кроме того, мы использовали Gene Expression Omnibus (GEO) и PubMed для получения наборов данных экспрессии для каждого термина фенотипа. Мы удалили всех позиционных кандидатов из списков генов, используемых для обучения, так что для обучения не использовались истинно положительные позиционные кандидаты. Используемые списки генов доступны в виде заархивированных текстовых файлов в дополнительном файле 5.

Сеть FNTM

Мы обучили вспомогательные векторные машины (SVM) классифицировать гены в каждом списке генов с использованием функций, полученных из FNTM (Goya et al. 2015). В этой функциональной геномной сети гены являются узлами, а весовые коэффициенты между ними представляют собой непрерывные значения от 0 до 1, предсказывающие степень, в которой каждая пара генов функционально связана. Более высокие значения указывают на более высокую прогнозируемую функциональную взаимосвязь. Функциональное родство в этой сети было предсказано посредством байесовской интеграции наборов данных из нескольких источников, включая экспрессию генов, данные о межбелковом взаимодействии и аннотацию к терминам GO (Goya et al. 2015). Мы загрузили верхние границы мышиной сети 15 января 2018 г. с http://fntm.princeton.edu.

Кластеризация наборов генов

Guan et al. (2010) заметил, что машины опорных векторов, обученные на 200–300 генах, дают наилучшую точность классификации. В двух из наших списков генов было менее 100 генов. Для всех списков из более чем 400 генов мы уменьшили размер обучающих наборов путем кластеризации каждого набора терминов генов в модули с использованием алгоритма fast greedy (Newman, 2004) в пакете R / igraph (Csardi, 2006).Мы применяли быстрый жадный алгоритм итеративно, пока все модули не содержали менее 400 генов. Использование максимального размера модулей 300 чрезмерно фрагментировало сети, давая много модулей с менее чем 100 генами.

Машинное обучение

Чтобы классифицировать позиционных кандидатов как принадлежащих к функциональному модулю, мы обучили SVM, используя веса соединений в сети FNTM в качестве функций, как описано в Guan et al. (2010). Вкратце, аннотированный набор генов (рис. 2A, синие узлы) используется как набор известных положительных результатов для соответствующего функционального модуля.Ожидается, что другие гены в этом модуле будут прочно функционально связаны с этими известными положительными генами, , то есть , имеют высокую вероятность функционального взаимодействия с известными положительными генами. Таким образом, каждый ген представлен как вектор признаков весов связи с известными положительными результатами, который можно визуализировать как подматрицу матрицы смежности сети (рисунок 2B). Соответственно, строки этой матрицы помечены как заведомо положительные или нет (рис. 2B, синие точки vs. серых точек). Мы использовали пакет e1071 в R (Meyer et al. 2018), чтобы обучить SVM отличать известные положительные гены от набора генов равного размера, выбранных случайным образом вне известного положительного списка с использованием сетевых векторов признаков ( Рисунок 2C). Обученная модель может затем аннотировать новые гены как принадлежащие к функциональному модулю, классифицируя любой ген в геноме (рис. 2C, узлы с зеленой рамкой).

Сетевое машинное обучение для функциональной аннотации генов.Известные положительные гены, аннотированные функциональным термином (синие узлы), обычно плотно взаимосвязаны в функциональной сети. B Матрица смежности сети — это табличное представление структуры связности сети, в которой каждая строка / столбец соответствует узлу сети, а связанные пары узлов имеют ненулевые значения в соответствующей ячейке матрицы. Обратите внимание, что в целом соединения взвешены, но для отображения мы показываем только существующие / отсутствующие ссылки (белые / черные ячейки).Связи каждого гена в геноме с известными позитивными элементами образуют подматрицу матрицы смежности, называемую матрицей признаков (вертикальные красные линии), строки которой являются векторами признаков для каждого гена. C Используя сетевые векторы признаков для каждого гена, мы обучаем SVM отличать известные положительные (синие точки) от случайных генов в геноме (серые точки), чтобы идентифицировать полную подсеть, соответствующую истинно положительным генам (точки с зеленой рамкой). и пунктирные красные линии на панелях A, B).

Мы обучили 100 SVM каждому модулю, выбирая новый набор случайных генов для каждого прогона.Мы использовали линейное ядро ​​и 10-кратную перекрестную проверку для каждой SVM. Мы обучили каждую SVM по ряду параметров стоимости. Мы начали с последовательности в 10 раз и итеративно сужали диапазон стоимостных параметров, пока не нашли серию из восьми стоимостных параметров, которая максимизировала точность SVM (см. Рабочий процесс).

Мы рассчитали площадь под кривыми ROC (AUC) для всех прогонов следующим образом: для последовательности в диапазоне от минимальной оценки SVM до максимальной оценки SVM мы количественно оценили все истинно положительные (TP), истинно отрицательные (TN) , ложные срабатывания (FP) и ложноотрицательные результаты (FN).Гены TP в этом случае были теми генами из известных положительных результатов, которые были правильно классифицированы как находящиеся в модуле (выше порога оценки SVM). Гены TN в этом случае были те гены вне модуля, которые были правильно классифицированы как находящиеся вне модуля (ниже порога оценки SVM). Мы рассчитали AUC по средней кривой для всех 100 SVM для каждого модуля.

Результаты

Генерация интервальных рекомбинантных конгенных линий (ISRCL) по локусу Histh

В предыдущей работе мы картировали генетический локус, регулирующий чувствительность к гистамину, зависящую от возраста и / или воспаления (CFA), на Chr 6 у мышей SJL / J (Raza et al. в печати). Конгенные мыши B10.S- Histh ^SJL демонстрировали Histh и несли большую область Mb SJL / J от 45,9 МБ до 127,8 МБ на устойчивом фоне B10.S (Raza et al. In Press) (MGI : 6360897). Этот большой QTL включает 628 генов, кодирующих белок. Чтобы сузить эту область, мы создали пять ISRCL, используя B10.S- Histh ^SJL x B10.S мышей обратного скрещивания, и оценили их восприимчивость к Histh (рис. 3). В рамках аддитивной модели эти данные предполагают, что Histh состоит из четырех суб-QTL, которые мы обозначили Histh2 (MGI: 6362992), Histh3 (MGI: 6362994), Histh4 (MGI: 6362996), и Histh5 (MGI: 6362997), каждый из которых вносит вклад в общую пенетрантность 17%, 19%, 14% и 10% соответственно.Важно отметить, что для каждого суб-QTL это делает идентификацию гена-кандидата позиционной с использованием интерактивного конгенного картирования с высоким разрешением непрактичной.

Обзор инбредных штаммов Histh

Чтобы выяснить, является ли фенотип Histh уникальным для SJL, мы оценили гистаминовые ответы для 23 инбредных линий мышей (включая SJL / J и B10.S; Таблица 1). Эти штаммы были выбраны с использованием структуры гаплотипов в интервале Histh для идентификации дополнительных линий мышей, которые, вероятно, имеют общий чувствительный аллель Histh (данные не показаны).Мыши 129X1 / SvJ, ALR / LtJ, BPN / 3J, FVB / NJ, NOD / ShiLtJ, NU / J, SJL / BmJ и SWR / J были идентифицированы как имеющие структуру гаплотипа, аналогичную SJL / J в локусе Histh . Мыши ALR / LtJ и SJL / BmJ требовали восстановления эмбрионов и поэтому не были включены в исследование. Фенотипирование Histh идентифицировало мышей FVB / NJ, SWR / J и NU / J как чувствительных к Histh, тогда как 129X1 / SvJ, NOD / ShiLtJ и BPN / 3J были устойчивыми. Взятые вместе с нашими более ранними данными, эти результаты показывают, что восприимчивость к Histh выделяется среди уникального подмножества штаммов, родственных SJL / J (Petkov et al. 2004).

Сетевое предсказание ассоциированных с Histh генов

Для прогнозирования функциональных кандидатов среди позиционных кандидатов в локусе Histh мы составили список биологических процессов, связанных с Histh, и обученные классификаторы машинного обучения для определения подсетей функциональных геномных сетей, связанных с каждым из этих процессов. Обзор нашего рабочего процесса представлен на рисунке 1. Сначала мы определили наборы генов, которые были связаны с семью терминами, которые функционально связаны с фенотипом Histh.

Термины и их обоснование следующие:

• Гиперчувствительность / анафилаксия I типа : реакция смерти после системной гистаминовой провокации проявляется симптомами гиперчувствительности / анафилаксии I типа, включая респираторный дистресс, вазодилатацию и анафилактический шок (Vaz ). и др. 1977).

• Сердечный : есть данные, свидетельствующие о том, что анафилактический шок у мышей связан со снижением сердечного выброса, а не исключительно функцией системной вазодилатации (Wang et al. 2014).

• Гистамин : Histh вызывается системным гистамином (Raza et al. In Press).

• Рецептор, связанный с G-белком : Гистаминовый рецептор H ₁ ( Hrh2 ) передача сигналов требуется для фенотипа Histh, и все рецепторы гистамина принадлежат к семейству рецепторов, сопряженных с G-белком (Hill et al. 1997).

• Старение : Спонтанная гистология развивается после шести месяцев у чувствительных линий мышей (Raza et al. в печати).

• Воспаление : Лечение провоспалительным CFA вызывает Histh у чувствительных линий мышей.

• Tuberculosis : Histh индуцируется у некоторых линий мышей CFA, который содержит инактивированные Mycobacterium tuberculosis (Raza et al. In Press).

• Сосудистая проницаемость : реакция Histh включает утечку сосудов в коже и скелетных мышцах согласно оценке Miles’assay (Raza et al. в печати).

Мы использовали Gene Weaver, Gene Expression Omnibus (GEO) и PubMed для получения наборов генов, связанных с каждым из этих терминов (см. Материалы и методы). Наборы генов имели размер от 651 до 1466 генов. Поскольку Guan et al. (2010) обнаружил, что SVM, обученные на наборах генов с примерно 300 генами, лучше всего подходят для сетевого функционального прогнозирования, мы сгруппировали большие наборы генов в модули примерно по 300 генов и проанализировали каждый модуль отдельно (см. Материалы и методы).В дополнительной таблице 4 показано количество генов в каждом модуле, а также пять основных условий обогащения для каждого с использованием пакета R gProfileR (Reimand et al. 2018). Множественные члены этих наборов генов кодируются в локусе Histh . Например, Hrh2 был членом набора генов Anaphylaxis. Чтобы уменьшить систематическую ошибку в классификации, мы удалили все такие гены из каждого набора генов перед обучением SVM. Затем мы обучили ансамбль из 100 SVM каждому набору генов модуля.Мы рассчитали кривые ROC для каждой модели, чтобы количественно оценить способность каждого набора SVM отличать гены внутри набора генов модуля от всех генов вне набора генов модуля. AUC варьировались от 0,9 до 0,975, что указывает на то, что SVM смогли надежно классифицировать гены в каждом списке. Другими словами, каждый набор генов, используемый для определения предполагаемого процесса, связанного с Histh, образует отдельную подсеть полнофункциональной геномной сети. Затем мы применили обученные модели SVM к позиционным генам-кандидатам в локусе Histh .Классифицируя каждого позиционного кандидата, мы можем идентифицировать гены, которые, вероятно, будут функционально связаны с каждым набором генов модуля. Например, для набора генов модуля анафилаксии рецептор гистамина Hrh2 получил положительную оценку, указывающую на то, что SVM предсказывали его принадлежность к набору генов анафилаксии, несмотря на его отсутствие в обучающей выборке. Этот пример представляет собой положительный контроль и показывает, что SVM идентифицируют биологически релевантные паттерны в функциональной геномной сети.Помимо оценки SVM, мы рассчитали количество ложных срабатываний () для каждого гена (см. Материалы и методы). Низкие значения s указывают на высокую степень уверенности в классификации. Детали этого анализа описаны в исполняемом рабочем процессе в качестве дополнения к этому документу (см. Доступность данных).

Интеграция функционального обогащения с генетической ассоциацией

Гены, которые, как предполагается, имеют высокую функциональную связь с признаком, могут не иметь функционально изменчивых аллелей в исследуемой популяции, и поэтому маловероятно, что они будут влиять на наблюдаемые различия штаммов в Histh.Чтобы идентифицировать гены, которые, вероятно, имеют функционально значимые полиморфизмы, мы интегрировали функциональные баллы со значениями SNP-ассоциации p , чтобы сосредоточиться только на тех кандидатах, которые удовлетворяли обоим критериям. Построив максимальный функциональный балл для гена, против (нормализованный до максимальных значений; см. Материалы и методы), мы можем идентифицировать гены, которые, как было предсказано, имеют как высокую функциональную связь с фенотипом Histh, так и, вероятно, имеют функциональные полиморфизмы. которые сегрегированы с восприимчивостью Histh (рис. 5).Синяя линия на рисунке 5 проходит вдоль Парето-фронта набора генов в этом пространстве. Для любого гена этой линии найти ген с более сильной функциональной ассоциацией означает найти ген с более низким значением SNP p и , наоборот, . Гены около фронта Парето имеют либо сегрегационный полиморфизм, либо, как предполагается, функционально связаны с Histh, либо и то, и другое. Все такие гены потенциально являются хорошими кандидатами для экспериментального наблюдения.

Чтобы ранжировать кандидатов с единственной оценкой, мы определили окончательную оценку гена () для каждого гена, которая является суммой (нормализованной) и (рисунок 6).Этот балл отдает предпочтение кандидатам в верхнем правом квадранте с одновременно высокими позиционными и функциональными баллами. Гены в верхнем правом квадранте — Cxcl12 , Ret и Cacna1c — имели почти максимальные баллы по обеим осям и поэтому были признаны лучшими кандидатами для последующего наблюдения. Полную таблицу оценок генов по модулям можно увидеть в дополнительной таблице 2.

В дополнение к идентификации гена с самым высоким рейтингом по полному локусу Histh , мы идентифицировали ген с самым высоким рейтингом для каждого суб-QTL, идентифицированного с помощью конгенных отображение.На рис. 6А показаны функциональные ассоциации по всем модулям 20 лучших генов, отсортированные по окончательной оценке гена (). Полную матрицу оценок для всех ранжированных генов можно найти в дополнительной таблице 2.

Обсуждение

В этом анализе мы идентифицировали небольшой набор позиционных генов-кандидатов в большом локусе путем объединения ассоциаций SNP с предсказанными функциональными ассоциациями с Histh. В результате тестов ассоциации SNP были получены группы SNP со многими значимыми и неразличимыми значениями p .На рис. 5 в правом нижнем углу показана группа генов, которые имеют максимально значимые значения p . Эти гены неотличимы только по величине p , но функциональная оценка в этом конвейере позволяет дифференцировать эти гены на основе родства с интересующими процессами. Более того, множественные гены, получившие высокие оценки по всему конвейеру, не получили максимально значимых значений p из тестов ассоциации SNP. Мы отнесли SNP к генам на основе близости, но это отнесение может вызвать ложные ассоциации между генами и фенотипами.Например, SNP может пометить регуляторный вариант, который влияет на несколько близлежащих генов, только некоторые из которых связаны с этим признаком. Более того, SNP не может полностью отделиться от причинного варианта. Сходным образом сложность генетической архитектуры, включая эпистаз, может приводить к снижению значимости одномерных ассоциаций SNP для истинно причинных SNP. Таким образом, гены с менее оптимальными значениями p можно не принимать во внимание, если значение p было единственным критерием ранжирования.Добавляя функциональный критерий к процессу ранжирования, мы можем защитить от сложностей картирования и ошибок назначения генов и определить, какие из позиционных кандидатов также могут быть функционально связаны с Histh. Окончательный список генов был весьма правдоподобным, и его можно относительно легко проверить с помощью современных методов генетического редактирования.

Высококачественные кандидаты на Histh

Особого внимания заслуживают три гена в итоговом ранжированном списке: Cxcl12 , Ret и Cacna1c .Эти гены не имели наиболее значимых значений p по всему локусу, но, как было предсказано, они были в высокой степени функционально связаны с процессами, связанными с Histh (Рисунок 5). Ген, занимающий первое место, Cxcl12 (также известный как фактор 1, полученный из стромальных клеток (Sdf1)), является хемотаксическим для тучных клеток через хемокиновый рецептор Cxcr4 (Ghannadan et al. 2002). Тучные клетки являются основными движущими силами патологических событий при анафилаксии (Либерман и Гарви, 2016), демонстрируя, что окончательные прогнозы очень важны для Histh.Кроме того, CXCL12 / SDF1, секретируемый опухолевыми клетками, связан с повышенной проницаемостью эндотелия как локально, так и системно. Второй по рангу ген Ret кодирует протоонкоген ret, трансмембранный рецептор клеточной тирозинкиназы, активация которого стимулирует множественные нисходящие пути, участвующие в дифференцировке, росте, миграции и выживании клеток, воспалении (Rusmini et al. ). 2013) и развития сердечно-сосудистой системы (Hiltunen et al. 2000). Вероятно, аллели этого гена могут модифицировать множественные процессы, лежащие в основе Histh, включая как анатомический фон, чувствительный к Histh, так и острую реакцию на гистамин. Ret был значительно связан с множеством функциональных наборов генов (рис. 6А). На третьем месте находится ген Cacna1c , кальциевый канал, зависимый от напряжения, L-тип, альфа-субъединица 1C, который экспрессируется в сердце, кровеносных сосудах и центральной нервной системе (веб-сайт информатики генома мышей).Мутации в Cacna1c связаны с электрофизиологическими изменениями в сердце (Napolitano et al. 2015; Hedley et al. 2009), предполагая возможную роль Cacna1c в нарушении сердечной функции при Histh. Интересно, что SNP в человеческом CACNA1C недавно были связаны с хронической спонтанной крапивницей (, т.е. , спонтанные эпизоды крапивницы и / или ангионевротического отека) и ответом на антигистаминные препараты (Yan et al. 2018).Эти результаты предполагают прямую связь между Cacna1c и гистаминовым ответом.

Все вышеперечисленные гены лежат в локусе Histh5 , который составляет лишь часть общей изменчивости фенотипа Histh. В локусе Histh4 первым был ген-кандидат Cntn3 , который кодирует контактин 3, также называемый белком суперсемейства 1 иммуноглобулинов головного мозга (BIG-1) или нейрональным гликопротеином, ассоциированным с плазмоцитомой (PANG). сообщалось в 1994 г. у крыс (Connelly et al., 1994; Yoshihara et al., 1994). Генетические варианты человеческого CNTN3 связаны с расстройством аутистического спектра (Morrow et al., 2008; Hussman et al., 2011) и сосудистыми аномалиями, лежащими в основе аневризм брюшной аорты (Elmore et al. 2009). Последнее предполагает потенциальную связь с нарушением сердечной функции во время провокации гистамином (Elmore et al. 2009). Интересно, что CNTN3 находится рядом с SNP, разделяющим синдром системной капиллярной утечки (SCLS) из человеческого GWAS.SCLS — чрезвычайно редкое заболевание, характеризующееся преходящими, но потенциально летальными эпизодами диффузной утечки из сосудов белков и жидкостей в периферические ткани, что приводит к массивному отеку всего тела и гипотензивному шоку. Патологические механизмы и генетическая основа SCLS остаются неуловимыми (Xie et al. 2013), но SCLS разделяет многие фенотипические свойства с Histh у мышей. В частности, приступы SCLS диагностируются на основании клинической триады гипотензии, повышенного гематокрита и гипоальбуминемии, все из которых естественным образом возникают у гист-чувствительных мышей линии SJL (Raza et al. в печати). Потенциальная ассоциация между CNTN3 и SCLS, следовательно, также подтверждает его возможную функциональную роль в Histh. Действительно, CNTN3 был не только позиционным кандидатом в SCLS GWAS, но содержался в функциональных терминах, которые были обогащены среди генов-кандидатов наивысшего положения (Xie et al. 2013), что указывает на то, что CNTN3 функционирует совместно с другими генетическими факторы риска SCLS.

В локусе Histh2 наибольшими хитами оказались Creb5 и Tril . Creb5 кодирует белок 5, связывающий цАМФ-чувствительный элемент. Creb5 имеет высокую экспрессию в сердце (Fagerberg et al. 2014) и участвует в сердечной функции и патологии (Schisler et al. 2015). Кроме того, CREB5 является компонентом возрастной воспалительной сети, лежащей в основе нерегулируемой экспрессии цитокинов, то есть воспаления. Tril является взаимодействующим с Tlr4 повторами, богатыми лейцином, и является функциональным компонентом комплекса Tlr4, участвующего в передаче сигналов LPS, и высоко экспрессируется в почках (Carpenter et al. 2009), что указывает на потенциальную роль Tril в регуляции артериального давления. Мыши Tril (- / -) также производят более низкие уровни множественных провоспалительных цитокинов и хемокинов в головном мозге после заражения E. coli и LPS (Wochal et al. 2014) и необходимы для передачи сигналов Tlr3, что предполагает потенциальную возможность роль в иммунной модуляции. В локусе Histh3 значимых совпадений не обнаружено.

Ни один из перечисленных здесь приоритетных генов не был протестирован специально на связь с Histh, и потребуется дальнейшая экспериментальная проверка.Однако каждый из вышеперечисленных генов имеет убедительные функциональные ассоциации, которые могут использоваться в последующих исследованиях.

Вычисление и прогноз гена количественного признака

Окончательная функциональная проверка гена количественного признака (QTG) традиционно требовала либо конгенного картирования для разрешения чрезвычайно узкого QTL, либо ad hoc номинации гена-кандидата для прямого эксперимента. Появление современных генетических технологий, таких как CRISPR / Cas9 (Hsu et al. 2014), позволяют относительно быстрые и недорогие аллельные манипуляции, поэтому бремя предсказания QTG смещается в сторону режима, в котором небольшая горстка сильных кандидатов может отслеживаться индивидуально. Важно отметить, что многие QTL, включая Histh , содержат несколько причинных вариантов, поэтому одно только точное отображение не может обеспечить окончательную проверку. Следовательно, вычислительные инструменты, которые могут идентифицировать небольшое количество разумных кандидатов, могут оказать существенную помощь в биологическом наблюдении. Мы представили интегративную стратегию ранжирования генов в QTL путем объединения предсказанных функциональных ассоциаций с признаком с ассоциациями SNP.Наш метод создает полный ранжированный список генов в локусе, что дает исследователям возможность проверить несколько целей. С этой целью QTL Histh представляет собой крайний вариант использования для прогнозирования QTG — большой полигенный QTL, связанный с физиологически сложным признаком.

Одним из основных ограничений нашего подхода является решение о том, какие функциональные термины включать для сетевого прогнозирования. Чем лучше этот набор приспособлен к интересующей характеристике, тем больше у нас будет уверенности в окончательных прогнозах.В принципе, включение ложного функционального термина может исказить ранжирование в сторону генов, которые функционально связаны с ложным термином, но не имеют отношения к интересующему признаку. Одним из возможных способов решения этой проблемы является использование функциональных данных, таких как транскриптомика, непосредственно от картографической популяции. Однако в некоторых случаях, включая Histh, соответствующая ткань, в которой можно измерить экспрессию гена, может быть неочевидной. В качестве альтернативы можно было бы рассмотреть отдельные рейтинги для каждого функционального термина.В любом случае исследователь должен будет проявить определенную долю суждения в процессе определения приоритетов. Однако, перенеся суждения из большого списка позиционных генов-кандидатов в меньший и более управляемый список биологических процессов, связанных с признаками, мы показали, что можем прийти к сильному набору последующих кандидатов, которые уклонились бы от наивных p значений фильтров и относительно объективны по результатам, опубликованным в литературе.

Еще одним ограничением этого подхода является наш метод присвоения генам значений p .В настоящее время мы используем значение p из единственного лучшего SNP в пределах 1 Мб тела гена, и эти SNP могут или не могут маркировать ген, которому они назначены. Существует несколько методов для присвоения значений p на основе генов, основанных на нескольких значениях SNP p , таких как Универсальный геномный тест для общегеномных ассоциативных исследований (VEGAS) (Liu et al. 2010), Combined Тест ассоциации генов (COMBAT) (Wang et al. 2017) и eigenMT (Davis et al. 2016). Однако ни один из этих методов напрямую не применим к текущему эксперименту, и получение статистики теста на основе генов, которая применима здесь, выходит за рамки данного исследования. Мы будем исследовать эту возможность для будущих реализаций этого метода.

Окончательный результат нашего метода, ранжированный список позиционных генов-кандидатов, легко интерпретируется и предоставляет исследователям четкий набор гипотез для проверки в лаборатории. Хотя этот подход не может окончательно идентифицировать причинный ген или гены в локусе, он предоставляет значительно сокращенный набор вероятных кандидатов для тестирования.

Благодарности

Мы благодарим Лауру Корт за руководство студентами во время генотипирования конгенных мышей. ALT и JMM поддерживаются грантом (R21 LM012615) Национальной медицинской библиотеки Национального института здоровья США (NIH). AR, DNK, EPB и CT были поддержаны грантами NIH и Национального общества рассеянного склероза (NMSS). DNK был поддержан грантами Национального института неврологических заболеваний и инсульта (R01 NS097596), Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (R21 AI145306) и NMSS (RR-1602-07780).

• Получено 26 июля 2019 г.
• Принято 20 октября 2019 г.

• Copyright © 2019 Tyler et al.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение в на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Цитированная литература

1. ↵
2. ↵
3. ↵
4. ↵
5. ↵
6. ↵
7. ↵
9. ↵
10. ↵
11. ↵
13. 900
14. ↵
15. ↵
16. ↵
17. ↵
18. ↵
19. ↵
20. ↵
21. ↵
22. ↵
23. ↵
24. ↵
25. ↵
26. ↵
27. Meyer,
28. Meyer, E. Dimitriadou, K. Hornik, A. Weingessel, and F. Leisch, 2018 e1071: Различные функции Департамента статистики, Группа теории вероятностей (ранее: E1071), TU Wien. Пакет R версии 1.7–0.

29. ↵
30. ↵
31. ↵
32. ↵

33. Raza, A., E.C. Chan, W.-S. Чен, З. Се, Л. М. Скотт, и др. , 2019 Натуральная модель мыши выявляет генетические детерминанты синдрома системной капиллярной утечки (болезнь Кларксона). Биология коммуникации.

34. ↵

    Рейманд, Дж., Р. Колде и Т. Арак, 2018 gProfileR: Интерфейс к набору инструментов ‘g: Profiler’ . Пакет R версии 0.6.7.

35. ↵
36. ↵
37. ↵
38. ↵
39. ↵
40. ↵
41. ↵
42. ↵
43. ↵
44. ↵
45. ↵

Fergus Ewing для компании LOW IN и MSPATING

Правительство Шотландии выделило 1,75 миллиона фунтов стерлингов на три инновационных проекта в области отопления.

В схемах на Шетланде, Клайдбанке и Глазго будет использоваться технология теплового насоса с водяным источником для извлечения тепла из воды — даже в самые холодные дни — для эффективного снабжения низкоуглеродным теплом.

Это:

• Кредит в размере 1,6 миллиона фунтов стерлингов для крупномасштабной схемы теплового насоса с источником морской воды в Леруике, чтобы позволить еще 225 домохозяйствам присоединиться к существующей тепловой сети
• Финансирование в размере 75 000 фунтов стерлингов для развития Queens Quay на территории бывшей верфи Джона Брауна для разработки инвестиционного проспекта для сети централизованного теплоснабжения с использованием водяного теплового насоса в бассейне реки Клайд.
• Финансирование в размере 75 000 фунтов стерлингов для Западного кампуса Университета Глазго для разработки предложения инвестиционного уровня по установке водяного теплового насоса на реке Кельвин, чтобы существующая сеть централизованного теплоснабжения могла обслуживать новые здания, запланированные на месте бывшей больницы Western Infirmary .

Министр энергетики Фергус Юинг сделал заявление сегодня на ежегодной конференции Scottish Renewables в Эдинбурге.

Г-н Юинг сказал:

«Поддержка развития централизованного теплоснабжения и более широких низкоуглеродных технологий поможет максимально использовать экономические возможности низкоуглеродного сектора Шотландии.

«По оценкам, на тепло приходится более половины общего энергопотребления Шотландии и почти половина выбросов парниковых газов в Шотландии, поэтому необходимость принятия мер совершенно очевидна.

«Непрерывный рост числа домов и предприятий, получающих выгоду от подключения к низкоуглеродному доступному теплу, обеспечиваемому сетями централизованного теплоснабжения, помогает правительству Шотландии реализовать наши амбиции по увеличению количества подключений к сетям централизованного теплоснабжения к 2020 году».

Дэйв Пирсон, директор Star Renewable Energy сказал:

«Star приветствует сегодняшнее объявление о том, что правительство Шотландии поддерживает два проекта по разработке предложений инвестиционного уровня по развертыванию тепловых насосов с водяным источником тепла.Наша компания уже несколько лет находится в авангарде использования больших тепловых насосов. В 2009 году мы приняли вызов, поставленный норвежским городом Драммен, по развертыванию большого водяного теплового насоса, собирающего тепло из фьорда для использования по всему городу в их системе централизованного теплоснабжения.

«Компания Drammen сократила свой углеродный след и выбросы из дымовой трубы более чем на 80 процентов, перейдя со сжигания газа на наш тепловой насос с температурой 90 ° C, достигнув целей COP21 2050, заявленных в Париже. Обязательство правительства Шотландии станет катализатором аналогичного шага в Шотландии, поскольку мы стремимся к значительной декарбонизации отопления.”

Тысячи домов будут отапливаться с помощью первой в своем роде системы «poo-power»

Вскоре тысячи домов можно будет отапливать за счет бытовых отходов с помощью первой в своем роде системы «poo-power».

Thames Water планирует использовать избыточное тепло, рекуперированное в процессе очистки сточных вод, для обогрева более 2000 новых домов в Кингстоне, на юго-западе Лондона, в рамках плана регенерации.

Вместо того, чтобы возвращать всю прошедшую окончательную обработку теплую воду непосредственно в реку, около одной трети будет улавливаться и отправляться в новый энергетический центр на территории компании Hogsmill, где она поможет нагреть воду, подключенную к жилому комплексу Kingston Cambridge Road. .

В случае успеха до семи гигаватт-часов низкоуглеродного тепла в год можно было бы поставлять через герметичную сеть труб в систему централизованного теплоснабжения в поместье, когда она в конечном итоге будет восстановлена.

Thames Water планирует затем расширить сеть, включив в нее общественные и коммерческие здания в центре города Кингстон.

Подробнее

Эта схема является первой в своем роде в Англии, но есть надежда, что она послужит моделью для аналогичных проектов в других местах Великобритании, сократив миллионы тонн выбросов углерода.

Thames Water заявила, что проект в Hogsmill позволит сэкономить 105 000 тонн выбросов в эквиваленте углекислого газа за 30 лет — столько же, сколько около 157 000 обратных рейсов из Лондона в Нью-Йорк или более 15 000 поездок на автомобиле по всему миру.

Подпишитесь на новости и советы по спасению планеты

Планируется, что будущие фазы сети централизованного теплоснабжения позволят сократить дополнительные выбросы и помогут Совету Кингстона достичь своей цели по снижению выбросов углерода к 2038 году.

(Вода Темзы)

Сара Бентли, исполнительный директор Thames Water, сказал: «Возобновляемое тепло из нашей канализационной сети — фантастический ресурс, поэтому жизненно важно, чтобы мы были ведущим игроком в энергетическом переходе и раскрыли весь потенциал« энергии пу ».

«Защита и улучшение окружающей среды чрезвычайно важны для нас, и мы взяли на себя обязательство сделать все возможное, чтобы найти новые и инновационные способы достижения наших чистых нулевых амбиций в течение следующих 10 лет.

«Мы уже самостоятельно генерируем значительное количество возобновляемой энергии на нашем огромном участке, удовлетворяя около четверти наших общих потребностей в электроэнергии, и уверены, что инновационные схемы централизованного теплоснабжения, подобные этой, предложат гораздо больше возможностей, чтобы гарантировать, что мы покинем нашу планету. в лучшем месте для будущих поколений.

Глава Совета Кингстона Кэролайн Керр добавила: «Это новаторский подход. Это впервые в Англии и показывает, что мы серьезно относимся к сокращению выбросов углерода в районе. Это реальная возможность проявить смелость и амбициозность для будущих поколений. Приятно работать вместе с Thames Water, превращая отходы в чистую энергию ».

Новости Великобритании в картинках

1/50 Новости Великобритании в картинках

Новости Великобритании в картинках

28 февраля 2021 года

Люди гуляют по пляжу в Скарборо, Северный Йоркшир

PA

Новости Великобритании в картинках

27 февраля 2021 года

Гроб капитана Тома Мура несут члены Вооруженные силы в крематории Бедфорда в Бедфорде

EPA

Новости Великобритании в фотографиях

26 февраля 2021 года

Собака стоит на скалах, когда солнце встает позади нее на пляже Нью-Брайтон, Wirral

PA

Новости Великобритании в фотографиях

25 февраля 2021 года

Теневой канцлер Аннелиз Доддс выступает перед бюджетом Института глобального процветания в штаб-квартире Лейбористской партии в Лондоне

PA

Новости Великобритании в картинках

24 февраля 2021 года

Министр здравоохранения Великобритании Мэтт Хэнкок выглядит на улице Даунинг-стрит в Лондоне, Великобритания

REUTERS

Новости Великобритании в картинках

23 февраля 20 21

Два серфера пробираются в море у пляжа Боскомб в Дорсете

PA

Новости Великобритании в фотографиях

22 февраля 2021 года

Крокусы цветут возле Тринити-колледжа в Кембридже

PA

Новости Великобритании в картинках

21 февраля 2021 года

Стрит-арт украшает многие улицы и стены вокруг района Дигбет в Бирмингеме

PA

Новости Великобритании в фотографиях

20 февраля 2021 года

Части Калландера в Стирлингшире затоплены после того, как река Тейт вышла из берегов

PA

Новости Великобритании в картинках

19 февраля 2021 года

Солнце встает над маяком Святой Марии, Нортумберленд

PA

Новости Великобритании в картинках

18 февраля 2021 года

Автомобили едут по трассе A1101 в Уэлни, Норфолк , который снова становится проходимым после двух месяцев затопления паводковыми водами

PA

Новости Великобритании в фотографиях

17 Февраль 2021 г.

Профессор Грин объявляет, что новый 25-километровый суперканал Tideway «направляется на восток», знаменуя собой важный этап в строительстве туннеля, поскольку две гигантские бурильные машины туннеля соединяются, чтобы прорваться в Бермондси и начать прокладку туннеля в направлении Восточного Лондона.После завершения канализационная система предотвратит попадание миллионов тонн неочищенных сточных вод в Темзу

PA

Новости Великобритании в картинках

16 февраля 2021 года

человек держит таблички с надписью «Я ПОТЕРЯНУ СВОЮ РАБОТУ !!» и «БОРИС, КТО ОПЛАТИТ ЭТОТ СЧЕТ? У МЕНЯ НЕТ ДЕНЕГ ДЛЯ ОПЛАТЫ КРЕДИТНОЙ КАРТОЙ »в окне его гостиничного номера в отеле Radisson Blu в Лондоне

Getty

Новости Великобритании в картинках

15 февраля 2021 года

Пассажиры, прибывающие в Терминал 5 аэропорта Хитроу: в сопровождении сотрудников службы безопасности до автобусов.С сегодняшнего дня люди, прибывающие из 33 стран «красного списка», в том числе из ЮАР и Объединенных Арабских Эмиратов, должны изолироваться в номерах отелей на 10 дней за свой счет. Политика была объявлена ​​в конце прошлого месяца в ответ на появление новых вариантов нового коронавируса, которые более устойчивы к существующим вакцинам.

Getty

Новости Великобритании в картинках

14 февраля 2021 года

Люди играют в хоккей на замерзших затопленных полях возле Эли в Кембриджшире

PA

Новости Великобритании в картинках

13 февраля 2021 года

в костюме премьер-министра Бориса Джонсона, маска для лица в сопровождении Сары Роуз (слева), доктора медицинских наук центра по производству средств индивидуальной защиты в Нортумбрии в Ситоне-Делавале

PA

Новости Великобритании в фотографиях

12 февраля 2021 года

Фонари висят на улице, чтобы отпраздновать китайский лунный Новый год Год, который отмечает Год Быка в китайском квартале в центре Лондона, во время третьего национального карантина в Англии для сдерживания распространения коронавируса.

PA

Новости Великобритании в фотографиях

11 февраля 2021 года

Вице-президент Европейской комиссии Марош Сефкович на вокзале Сент-Панкрас в Лондоне после прибытия в Великобританию перед переговорами с министром кабинета министров Майклом Гоу по протоколу Северной Ирландии.

PA

Новости Великобритании в картинках

10 февраля 2021 года

Замерзший дорожный знак и живая изгородь покрыты сосульками, поскольку шторм Дарси поражает большую часть страны, в Шенли, Хартфордшир

Reuters

Новости Великобритании в картинках

9 февраля 2021 года

Люди идут по Гарднер-стрит в Глазго, когда снег покрывает город

AFP / Getty

Новости Великобритании в картинках

8 февраля 2021 года

Снег укрывает автомобиль в Харвуде, графство Дарем

PA

Новости Великобритании в картинках

7 февраля 2021 года

Люди идут по снегу в парке Ноле в Севеноуксе

Getty

Новости Великобритании в картинках

6 февраля 2021 года

Мальчик катается на санях в Мулен-Мур возле Питлохри, как шторм Дарси приближается, в Шотландии

Reuters

Новости Великобритании в фотографиях

5 февраля 2021 года

Ассистент исследовательского центра Лайла Хиллсде n с редкой копией фолио Бомонта и Флетчера 1647 года, антологии пьес Джона Флетчера и Уильяма Бомонта, из личной библиотеки короля Карла II, которая недавно была приобретена Специальными коллекциями в Университете Лидса

PA

Новости Великобритании в фотографиях

4 февраля 2021 года

Эл Гудридж из Ньютонмора использует топор, чтобы создать канал во льду, чтобы его жена Алиса могла плавать в Лох-Инше, в национальном парке Кэрнгормс

PA

Новости Великобритании в картинках

3 февраля 2021 г.

Фреска с изображением капитана сэра Тома Мура работы художника Роберта Ньюбиггина украшает стену в Саутпорте.Ветеран Второй мировой войны собрал почти 33 миллиона фунтов стерлингов для благотворительных организаций NHS в преддверии своего 100-летия в прошлом году, прогуливаясь по своему саду в Марстон-Мортейне, Бедфордшир. Он был госпитализирован в больницу Бедфорд в эти выходные после положительного результата теста на Covid-19 и вчера умер в присутствии своей семьи

Getty

Новости Великобритании в фотографиях

2 февраля 2021 года

Полицейские удаляют активиста-эколога, протестующего против высокой скорости HS2. железнодорожная ветка с крыши офиса HS2 в центре Лондона 2 февраля 2021 года.- Разработанный для работы в бывшем промышленном центре Бирмингема, а затем в Манчестере и Лидсе, HS2 должен был следовать от южного лондонского соединения Eurostar с Парижем

AFP через Getty Images

Новости Великобритании в фотографиях

1 февраля 2021 года

Кристин Барри поднимает двухлетнего сына Орана, чтобы поцеловать статую святой Бригитты, когда они посещают святой колодец святой Бригитты в Ко Килдэр, чтобы отметить День святой Бригитты, который многие в Ирландии считают первым днем ​​весны

PA

Новости Великобритании на фотографиях

31 января 2021 года

Люди выгуливают собаку в парке Pugneys Country Park в Уэйкфилде, Западный Йоркшир

PA

Новости Великобритании в фотографиях

30 января 2021 года

Пожарные осматривают обугленные остатки квартала в Napier Barracks после Полиция заявила, что в Фолкстоне, Англия, был преднамеренно начат пожар.Казармы Нэпир, часть заброшенных казарм Сомерсет-хауса сэра Джона Мура, с лета прошлого года использовались для размещения просителей убежища, прибывающих из Франции на Южное побережье. Сообщается, что 120 из 400 человек, размещенных там, заразились коронавирусом, и приходящий врач описал условия жизни как «бесчеловечные»

Getty

Новости Великобритании в фотографиях

29 января 2021 года

Члены мусульман-ахмадийцев Община принимает участие в пятничной молитве в мечети Байтус Субхан в Кройдоне, Англия.В течение почти последнего года пандемия Covid-19 и связанное с ней ограничение общественных собраний вынудили религиозные общины искать новые способы соблюдения молитв, при этом многие события отмечались дома. Мечети, как и другие места религиозного поклонения, остаются открытыми, хотя их количество было ограничено, чтобы поддерживать социальное дистанцирование

Getty

Новости Великобритании в картинках

28 января 2021 года

Художественные работы с изображением животных, созданные Раймондом и Леонардом, показаны на окно дома в Актоне, Лондон, для открытия The Great Big Art Exhibition, крупнейшей в стране выставки, по инициативе Firstsite

PA

Новости Великобритании в фотографиях

27 января 2021 года

Рыбацкие лодки, некоторые из них заброшены, лежат в водах реки Уайр в Флитвуде в Ланкашире

PA

Новости Великобритании в фотографиях

26 января 2021 года

Группа друзей катится на санях в заснеженном парке Lickey Hills Country Park, Бирмингем

PA

Новости Великобритании в картинках

25 января 2021 года

Велосипедист наблюдает за восходом солнца с Примроуз-Хилл

PA

Новости Великобритании на фотографиях

24 Janaury 2021

Люди катаются на санях по снегу на Парламентском холме в Хэмпстед-Хит

Getty

Новости Великобритании в фотографиях

23 января 2021 года

Дениз Мандей (слева) и Рут Ричардс (справа) проверяют, как Спасенные бывшие куры Рут в паводке в ее доме недалеко от Набурн-шлюза в Йорке после сильного дождя во время шторма Кристоф

PA

Новости Великобритании в фотографиях

22 января 2021 года

Очистка, поскольку паводковая вода начинает отступать от город Нортвич, Чешир, после шторма Кристоф

Getty

Новости Великобритании в фотографиях

21 января 2021 года

Члены службы экстренной помощи работают над эвакуацией жителей Дома престарелых после того, как они оказались в результате наводнения, в Нортвиче, северо-западная Англия, поскольку шторм Кристоф приносит проливные дожди и наводнения по всей Англии

AFP via Getty

Новости Великобритании в картинках

20 января 2021

Наводнение под трассой A46 на Six Hills Lane в Лестершире, поскольку шторм Кристоф собирается принести масштабные наводнения, ураганы и снегопады в некоторых частях Великобритании

PA

Новости Великобритании в фотографиях

19 января 2021 года

Серфер оседлал волну в море у пляжа Боскомб в Дорсете

PA

Новости Великобритании в фотографиях

18 января 2021 года

Премьер-министр Великобритании Борис Джонсон стоит у комнаты, где техники производят вакцину AstraZeneca covid-19 в Oxford Biomedica , в Оксфорде

Reuters

Новости Великобритании в картинках

17 января 2021 года

Люди на берегу моря в Брайтоне во время третьей национальной блокировки Англии для сдерживания распространения коронавируса

PA

Новости Великобритании в картинках

16 января 2021

В соборе Солсбери, графство Уилтшир, установлены отсеки для людей, которым вводят вакцину от коронавируса Pfizer. e

PA

Новости Великобритании в картинках

15 января 2021 года

Транспортные средства проезжают по затопленной дороге в Маунтсоррел, Лестершир, с большой полосой Англии, охваченной 30 предупреждениями о наводнении к обеду в пятницу

PA

Новости Великобритании в картинках

14 января 2021 года

работников NHS из больниц по всей столице во время социально дистанцированной акции протеста за пределами Даунинг-стрит в Лондоне, приуроченной к еженедельным аплодисментам для героев

PA

Новости Великобритании в картинках

13 января 2021 года

Уведомление общественного здравоохранения о необходимости «оставаться дома» на автобусной остановке в Лондоне

EPA

Новости Великобритании в картинках

12 января 2021 года

Солнце встает за замком Скарборо в Йоркшире

PA

Новости Великобритании в картинках

11 января 2021 г.

Медицинский работник наполняет шприц вакциной против Covid-19 в центре вакцины NHS, который был открыт в ЦБ.