Телевизоры хайер кто производитель: Haier: бренд, производитель, дистрибьюторы Haier

46

Кто на самом деле убил Малкольма Икса?

Более полувека ученые утверждали, что прокуроры признали виновными в убийстве Малкольма X не тех людей.

Сейчас, спустя 55 лет после того кровавого дня в феврале 1965 года, окружная прокуратура Манхэттена рассматривает вопрос о возобновлении расследования убийства.

Некоторые новые доказательства получены из документального фильма из шести частей под названием «Кто убил Малкольма Икс?», Транслируемого на Netflix 7 февраля, в котором утверждается, что двое из осужденных мужчин не могли быть на месте происшествия в тот день.

Вместо этого он указывает пальцем на четырех членов мечети «Нация ислама» в Ньюарке, штат Нью-Джерси, изображая их участие в жизни своего города как секрет полишинеля.Один даже появился в рекламной кампании 2010 года тогдашнего мэра Ньюарка Кори Букера.

«Что нас зацепило, — сказала Рэйчел Дретцин, режиссер документального фильма вместе с Филом Бертельсеном, — так это представление о том, что вероятный убийца из дробовика Малькольма Икса живет у всех на виду в Ньюарке, и что многие люди знали о его причастность, и он не был расследован, не преследовался, не подвергался сомнению ».

Это дело давно соблазняет ученых, которые видят заговор, скрытый в неизданных правительственных документах.Сыщик по этому делу Энтони Боуза несколько лет назад категорически написал: «Расследование было неудачным».

Тем не менее, это никогда не вызывало всеобщего навязчивого интереса к убийству Кеннеди или столь же наглому убийству Тупака Шакура. Попытки возобновить дело — раскрыть возможные роли ФБР, Департамента полиции Нью-Йорка и руководства «Нации ислама», включая Луиса Фаррахана, ни к чему не привели.

«Подавляющее большинство белых в то время считали, что это преступление черных против черных и, возможно, преступление черных экстремистов против черных экстремистов», — сказал Дэвид Гарроу, историк гражданских прав, лауреат Пулитцеровской премии.«И в течение десятилетий в черных сообществах существовал консенсус, что мы не собираемся поднимать этот камень, чтобы увидеть, что под ним».

В то время, когда Малькольм выступал в бальном зале Одюбона 21 февраля 1965 года, он был заметным человеком — за ним шпионило ФБР. и полиция, которую руководство нации объявило предателем, внутренне ненавидела и любила. Г-н Фаррахан объявил его «достойным смерти». За неделю до его убийства в его дом в Квинсе взорвали бомбу, в то время как он, его жена и четыре дочери спали внутри.

Через несколько секунд после того, как Малькольм вышел на кафедру, раздались выстрелы, а затем царил хаос.

Талмадж Хайер, член «Нации ислама» из мечети Нью-Джерси, был арестован, бежав из бального зала, с обоймой от пистолета, использованного при убийстве. Позже полиция арестовала двух мужчин из бывшей мечети Малькольма в Гарлеме, Нормана 3X Батлера и Томаса 15X Джонсона, известных как силовики.

На суде г-н Хайер, впоследствии ставший Муджахидом Абдул Халимом, признал свою вину, но сказал, что двое других мужчин невиновны.Все трое были осуждены и приговорены к пожизненному заключению. Г-н Джонсон, ставший Халилом Исламом, умер в 2009 году; Г-н Батлер, ныне Мухаммад Абдул Азиз, был условно-досрочно освобожден в 1985 году и до сих пор заявляет о своей невиновности.

В конце 1970-х г-н Халим подал письменные показания под присягой, назвав четырех членов мечети Ньюарка своими соучастниками в преступлении. Адвокат по гражданским правам Уильям Кунстлер ходатайствовал о возобновлении дела, но ему было отказано.

С тех пор беготня ложится на плечи биографов и независимых исследователей, в том числе Вашингтон, Д.К., гид по имени Абдур-Рахман Мухаммад, центральная фигура в новом документальном сериале.

«Меня беспокоило то, что это никого не волновало, — сказал г-н Мухаммед. «Мне не платили ни за что из этого. Я продавал машины. Я просто парень из рабочего класса ».

Г-н Мухаммед в 2010 году раскрыл личность одного из предполагаемых убийц, названных в показаниях г-на Хайера, Уильяма Брэдли, который сменил имя на Альмустафа Шабазз и был женат на известном ньюаркском активисте. Исследователи утверждают, что именно выстрел из дробовика мистера Брэдли убил Малькольма.

Г-н Шабазз, умерший в 2018 году, отрицал свою причастность к убийству и жил у всех на виду. «Я хорошо его знал», — говорит Кори Букер в документальном фильме, добавляя, что ему не было известно о прошлой личности г-на Шабаза.

Г-н Мухаммад опубликовал имя и фотографию г-на Шабаза в своем блоге в 2010 году, а затем поделился своим исследованием с Мэннингом Мараблом, который работал над своей удостоенной Пулитцеровской премии биографией «Малкольм Икс: жизнь переосмысления». Г-н Мухаммед считает, что трое других мужчин, упомянутых в имени г-наПоказания под присягой Хайера мертвы.

После выхода книги Элвин Сайкс, активист из Канзас-Сити, помогавший убедить ФБР. и министерство юстиции, чтобы создать отдел по расследованию убийств в эпоху гражданских прав, лоббировали федеральных прокуроров с целью повторного расследования убийства Малкольма. Департамент отказался. Когда г-н Шабазз умер, последним оставшимся нерешенным делом был г-н Азиз, бывший Норман 3X Батлер, которому сейчас 81 год, отсидевший 20 лет за преступление, которое, как он утверждает, он не совершал.

Адвокаты г-на Азиза теперь надеются, что окружной прокурор Манхэттена очистит его имя. Представитель прокуратуры Сайруса Р. Вэнса-младшего заявил в своем заявлении, что предварительная проверка «проинформирует офис о том, какие дальнейшие следственные действия могут быть предприняты». Один из прокуроров, проводивших проверку, Питер Казоларо, сыграл жизненно важную роль в отмене обвинительных приговоров пяти мужчинам, незаконно заключенным в тюрьму за изнасилование бегуна в Центральном парке в 1989 году.

Г-н Азиз, который отклонил запрос об интервью, сказал в тот день он не мог быть в Одюбоне, потому что охрана заблокировала бы его вход, и что в любом случае он был почти неподвижен из-за того, что недавно избила полиция.В документальном фильме он выражает мало надежды на этот процесс. «Я просто не верю в этих людей», — говорит он. «У меня есть 20 лет жизни, чтобы показать, что я не должен в них верить».

Не все убеждены. Карл Эванзз, автор книги «Фактор Иуды: заговор с целью убить Малкольма Икса», процитировал кадры из фильма, в которых, по его словам, изображен г-н Азиз в Одюбоне, и отклонил исследование г-на Мухаммеда как ненадежное.

Дэвид Шенис, который в «Проекте невиновности» представляет г-на Азиза, сказал только, что юристы рассчитывают на сотрудничество с прокуратурой, «чтобы добиться справедливости».В их случае фигурирует ФБР. документы, которые никогда не передавались в местную полицию или прокуратуру. Барри Шек из «Проекта невиновности» заявил, что на основании этих доказательств «мы обеспокоены тем, что приговор не был отменен в 1978 году», когда г-н Хайер подал письменные показания под присягой.

Если окружной прокурор поддерживает обвинительный приговор, юристы могут подать возражение в Верховный суд штата.

Но даже если господин Азиз победит, это не решит вопросов о более крупных силах, которые, по мнению многих, способствовали смерти Малькольма — правоохранительных органах, которые шпионили за ним, но не смогли его защитить, лидерах нации, которые молчаливо призывали его голову. .Эта часть истории вместе с неизданными томами ФБР. файлы, могут никогда не всплыть полностью.

«Когда вы имеете дело со сложным преступлением и упрощаете его до пяти членов Нации Ислама, идущих в бальный зал, вы не даете людям нужный контекст», — сказал Зак Кондо, автор книги «Conspiracys» : Раскрытие убийства Малкольма Икса ».

«Целое поколение ушло в могилы, зная важную информацию, которую такие люди, как я, никогда не узнают», — сказал он. «Это самая неприятная часть.»

The Recorder — Местные студенты принимают участие в программе« Доктор на день »

ГРИНФИЛД — Джеффри Хейер, в возрасте 8 или 9 лет, смотрел передачу по телевизору вместе со своим отцом, адвокатом. Часть увиденного он видел, как врачи помогают детям-инвалидам.

Хайер повернулся к отцу и сказал, что, если он не возражает, он хотел бы стать костным доктором, чем он и стал.

Хайер занимается медициной в течение четырех десятилетий, но все еще может быстро вспомнить свои сны, разговаривая с двумя студентами, которые следили за ним в течение дня.

«Я не говорю, что это лучшая вещь в мире для врача, но в то же время это призвание», — сказал Хайер, уроженец Гринфилда.

Программа слежки была частью программы «Доктор на день», спонсируемой местным отделением Массачусетского медицинского общества. Во вторник слежка проводилась в кабинете Хейера на Ридделл-стрит, а также в медицинском центре Бэйстейт Франклин. Хайер сказал, что участвует в программе примерно последние 20 лет.

«Вы имеете дело с молодыми умами, их глаза широко открыты, и вы имеете дело с невероятными мечтами», — сказал Хайер.«Я пытаюсь дать им дозу реальности».

Это включало в себя пропуск двух студентов в палаты с пациентами, которых он принимал, при условии, что пациенты были в порядке с этим. После нескольких посещений Хайер привел студентов в свой кабинет для подведения итогов. Он спросил их, что они считают самым сложным из того, что они видели, и затем объяснил им это.

«Это действительно укрепило мою идею о том, что да, я действительно хочу заниматься медициной», — сказала 18-летняя ученица региональной школы Mohawk Trail Брианн Кузино, следя за Хейером часть дня.«Это другое, чем просто быть пациентом и смотреть, что происходит».

Брианна сказала, что ее мечта стать врачом началась около двух лет назад, когда член семьи заболел, и она часто лежала с ними в больнице.

Ученик средней школы Гринфилд 15-летний Виктор Иванцев много лет хотел стать врачом. Оба его родителя работают в поле.

«Мне всегда нравятся их профессии, и я стремлюсь быть похожими на них», — сказал Виктор, который также следил за Хейером.Он сказал, что хочет быть кардиологом, и слежка «действительно открыла мне глаза на то, что есть и чем может стать медицина».

Хайер сказал, что работать врачом может быть непросто, потому что нет регулярного графика. Он назвал это «жонглированием» и может вызвать стресс для вашей семьи.

«Я не говорю, что это лучшая вещь в мире для врача, но в то же время это призвание», — сказал он. «На Уолл-стрит можно заработать намного больше денег».

Напротив, Хайер пытался научить ценить не только то, что он врач, но и то, как лучше всего справиться с этим жонглированием.Он рассказал Брианне и Виктору о своем пчеловодстве и других увлечениях, которые помогают ему не увязнуть в карьере.

«Я сказал им, что если вы начнете заниматься этой профессией, сохраняйте смирение, потому что вы будете унижаться каждый день».

Свернувшись в кучу, как группа врачей в дискуссии, Хайер рассказал двум студентам один из своих самых важных уроков, который не имел ничего общего с костями, но все касался людей. Он сказал всегда помнить имена людей, говоря, что это единственное, что нельзя отнять у человека.«Найдите время, чтобы поздороваться с людьми и послушать, что они говорят, — сказал он, — потому что это будет бесценно».

Некитайские телевизионные бренды, которые вы можете покупать и смотреть свои любимые фильмы и шоу на

Из-за растущей напряженности между Индией и Китаем люди в Индии отказываются от использования китайских продуктов, чтобы не отдавать бизнес китайским компаниям. Есть много некитайских телевизионных брендов, которые можно использовать вместо того, чтобы покупать телевизор, произведенный в Китае. Некоторые из них также производятся телевизионными брендами «Сделано в Индии».

Также читают | Сделано в Индии Холодильники: вот несколько холодильников индийского производства для охлаждения продуктов

Вот список некитайских телекомпаний

LG Electronics

LG Electronics — один из ведущих производителей телевизоров за пределами Китая. Это южнокорейская транснациональная электронная компания. Штаб-квартира компании находится в Ёвидо-донге, Сеул, Южная Корея. LG Electronics занимает прочную позицию на индийских рынках, и ее телевизоры обеспечивают отличные впечатления от просмотра с потрясающими функциями.Существуют различные типы телевизоров LG, такие как LED, OLED и плазменные телевизоры. LG E9 OLED — одна из лучших моделей бренда, а LG B9 OLED по очень разумной цене, согласно новостному онлайн-порталу.

(Источник: Facebook компании LG)

Panasonic Corporation

Panasonic Corporation ранее называлась Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Компания базируется в Кадоме, Осака, и является японской многонациональной компанией по производству бытовой электроники. Компания Panasonic была основана в 1935 году, а затем переименована в 2008 году.Самая любимая модель телевизора Panasonic — Panasonic TX-55GZ2000. Его превосходная яркость OLED-панели и реализация Dolby Atmos дают лучшие результаты, несмотря на высокую цену. Еще одна удачная модель — TX-50GX700B.

(Источник: Facebook Panasonic)

Samsung

Samsung — корейский многонациональный конгломерат. Штаб-квартира находится в городе Самсунг, Сеул. Она была основана Ли Бён Чулем в 1938 году как торговая компания и к 1960-м годам вошла в электронную промышленность. Компания Samsung представила широкий спектр светодиодных и интеллектуальных телевизоров, которые не только доступны по цене, но и обладают лучшими функциями.Цены варьируются от 14990 до 31990 вон. Это TE50A Smart HD TV — модель, на которую стоит обратить внимание.

(Источник: Facebook Samsung)

Также читают | Индийские телевизионные бренды: вот список телевизоров, произведенных в Индии

Корпорация Sharp

Sharp Corporation также является одной из некитайских телекомпаний, расположенных в Японии. Эта японская корпорация разрабатывает и производит различную электронную продукцию. Его штаб-квартира находится в Сакаи-ку, Сакаи, префектура Осака, и была основана в 1912 году.В 1950-х компания Sharp также создала несколько удивительных портативных телевизоров. Он имеет полный спектр телевизоров от 32 до 70 дюймов по разумным ценам.

(Источник: Facebook Sharp)

Sony Corporation

Sony Corporation также является японской транснациональной корпорацией, производящей бытовую и профессиональную электронику. Штаб-квартира находится в Конане, Минато, Токио. Она была основана в 1946 году. Продукция Sony также является одной из самых востребованных на индийских рынках. Sony X950H и Sony Z9F — две отличные модели компании.

(Источник: Sony Facebook)

Toshiba

Компания Toshiba также является японским транснациональным конгломератом со штаб-квартирой в Минато, Токио. Наряду с электроникой компания предлагает различные продукты в области информационных технологий и связи. Toshiba 49U7763DB с 4K-телевизором — отличная модель телевизора от компании. Он предоставляет одни из лучших телевизоров по доступным ценам и потрясающим функциям.

(Источник: Facebook Toshiba)

Также читают | Индийские мобильные компании: вот список сотовых телефонов, которые сделаны в Индии

Сделано в Индии Телевизоры брендов

Онида

Onida — индийская электронная компания, начавшая свой путь в 1981 году.Они начинали исключительно как телевизионную брендовую компанию, а затем постепенно перешли на производство другой бытовой техники. «Это зависть соседа», слоган гордости владельца — один из самых запоминающихся в истории индийской рекламы. Компания имеет два производственных предприятия в Ваде, Махараштре и Рурки в Уттаракханде. Они производят более 3,4 миллиона телевизоров. Onida предлагает широкий выбор великолепных телевизоров, интеллектуальных светодиодных телевизоров с FIRE TV от 20 000 до 99 000 единиц.

(Источник: Facebook Ониды)

Videocon Industries

Одна из популярных индийских телекомпаний — Videocon Industries, основанная в 1985 году в Аурангабаде.Его начал Нандлал Мадхавлал Дхут. По словам Анирудха Дхута, его внука, Videocon была первой компанией, которая привезла цветные телевизоры в Индию. Он имеет более 100 моделей телевизоров с дисплеями от 24 до 98 дюймов. Высококачественные телевизоры Videocon включают в себя Ai Smart TV, жидкокристаллический дисплей, Ultra HD, возможность беспроводного подключения дисплеев и даже имеют звездный рейтинг, что означает, что они экономят электроэнергию.

Также читают | Индийские производители ноутбуков: вот список ноутбуков, произведенных в Индии

Кавеолин-1 убиквитинирован и нацелен на внутрипросветные пузырьки в эндолизосомах для деградации

Abstract

Кавеолы ​​- это долгоживущие микродомены плазматической мембраны, состоящие из кавеолинов, кавинов и богатой холестерином мембраны.Мало что известно о том, как разбираются кавеолы ​​и как разрушаются компоненты их оболочки. Мы изучили деградацию кавеолина-1 (CAV1), основного кавеолярного белка, в клетках CV1. CAV1 деградировал очень медленно, но оборот можно было ускорить, нарушив сборку кавеол. Теперь CAV1 стал обнаруживаться в поздних эндосомах (LE) и лизосомах, где он деградировал. Нацеливание на путь деградации требует убиквитинирования и эндосомного сортировочного комплекса, необходимого для транспортного механизма (ESCRT) для включения во внутрипросветные пузырьки в эндосомах.Стратегия двойной метки позволила нам отслеживать воздействие CAV1 на кислый просвет отдельных созревающих LE в живых клетках. Важно отметить, что мы обнаружили, что «кавеосомы», ранее описанные нашей группой как независимые органеллы, отличные от эндосом, на самом деле соответствуют поздним эндосомным компартментам, модифицированным накоплением сверхэкспрессированного CAV1, ожидающего деградации. Полученные данные привели нас к пересмотренной модели эндоцитарного переноса CAV1.

Введение

Кавеолы ​​представляют собой небольшие инвагинации плазматической мембраны на поверхности многих типов клеток млекопитающих.Они участвуют в различных физиологических процессах, включая эндо- и трансцитоз, проникновение патогенов, регуляцию липидов, передачу сигналов и рак (Razani et al., 2002; Parat, 2009). Они могут проникать в клетку в форме эндоцитозных пузырьков, которые стыкуются с эндосомными органеллами для доставки грузов (Pelkmans et al., 2004; Parton and Simons, 2007). В плазматической мембране и во время цикла везикулярного транспорта кавеолярная оболочка остается плотно связанной с мембраной, что резко контрастирует с другими оболочками везикул, такими как клатрин или COPI / II (Tagawa et al., 2005).

Кавеолярная оболочка состоит из двух основных слоев белка. Внутренний слой немышечных клеток состоит из CAV1 (кавеолин-1) и CAV2. Кавеолины представляют собой интегральные мембранные белки с центральным гидрофобным доменом, вставленным в виде петли внутри мембраны. Когда оба конца N и C обращены к цитоплазме, CAV1 принимает топологию шпильки (Dupree et al., 1993; Monier et al., 1995). С CAV1 в качестве основной организующей субъединицы два кавеолина образуют взаимосвязанный каркас, который определяет размер и многие из общих свойств микродомена.Недавно обнаруженные полости обеспечивают внешний периферический цитозольный белковый слой. Они составляют большие гетеролигомерные комплексы, которые покрывают сильно изогнутую мембрану кавеол плазматической мембраны (Bastiani et al., 2009; McMahon et al., 2009; Hayer et al., 2010). Считается, что они стабилизируют кавеолиновый каркас, способствуют кривизне мембран и регулируют отрастание кавеол (Hill et al., 2008; Liu and Pilch, 2008; Bastiani et al., 2009; Hansen et al., 2009; McMahon et al. , 2009). Липидный бислой, связанный с кавеолами, представляет собой специализированный микродомен, обогащенный холестерином и сфинголипидами.

Кавеолины синтезируются в ER, где они быстро образуют SDS-устойчивые 8S олигомеры, содержащие 7-10 молекул CAV1 и CAV2 (Scheiffele et al., 1998; Fernandez et al., 2002; Hayer et al., 2010). После COPII-зависимого транспорта к комплексу Гольджи, 8S олигомеры связываются с холестерином и друг с другом, чтобы сформировать вышеупомянутый заделанный мембраной каркас, состоящий из 15-25 8S комплексов. Каркасы осаждаются в виде частиц 70S при извлечении из мембраны и делипидировании (Hayer et al., 2010). Особый везикулярный путь отвечает за транспортировку каркасов кавеолинов к плазматической мембране, где кавины связываются с ними в форме больших 60S комплексов (Hayer et al., 2010).

После правильного формирования кавеолы ​​в плазматической мембране представляют собой стабильные структуры, в которых ни кавеолины, ни кавины не подвергаются быстрому обороту. Они могут быть активированы и подвергаться эндоцитарной интернализации (Kirkham et al., 2005; Tagawa et al., 2005), и есть доказательства, что они могут участвовать в циклах слияния и деления с плазматической мембраной (Pelkmans and Zerial, 2005).Холестерин необходим не только для сборки кавеол, но и для стабильности (Rothberg et al., 1992). Кавины также вносят вклад в стабильность кавеол, поскольку подавление кавина-1 укорачивает период полужизни CAV1 (Hill et al., 2008; Hansen et al., 2009). Поскольку деградация CAV1 после подавления регуляции cavin-1 чувствительна к лизосомным ингибиторам, возможно, что это происходит в лизосомах (LYS; Hill et al., 2008). Однако сообщалось, что мутанты CAV1, которые не могут собираться в кавеолы ​​и, таким образом, остаются в ловушке Гольджи, и CAV2, экспрессируемые в отсутствие CAV1, разлагаются протеасомным путем (Galbiati et al., 2000; Разани и др., 2001).

В этом исследовании мы обращаемся к процессам, с помощью которых кавеолы ​​и CAV1 подвергаются сборке, разборке и особенно деградации. Изменяя баланс различных компонентов кавеол в клетке (CAV1, cavin-1 и холестерин), мы могли ингибировать сборку кавеол, тем самым ускоряя деградацию CAV1. Таким образом, сгенерированный несобранный CAV1 был нацелен на эндосомы, убиквитинирован, секвестрирован во внутрипросветных пузырьках (ILV) эндосомным сортировочным комплексом, необходимым для механизма транспорта (ESCRT), и разложился в LYS.Вакуоли, ранее описанные как кавеосомы, можно было идентифицировать как поздние эндосомы (LE) и LYS (LE / LYS), обогащенные CAV1, предназначенные для деградации.

Результаты

Несобранный кавеолин в плазматической мембране

Чтобы узнать больше о жизненном цикле кавеол и о деградации CAV1, мы проанализировали последствия нарушения соотношений и доступности кавеолярных компонентов в клетках CV1. Манипуляции выполнялись тремя способами: истощение клеток холестерина, сверхэкспрессия CAV1 и подавление экспрессии cavin-1.

Истощение холестерина проводили в клетках CV1, стабильно экспрессирующих CAV1-мономерный EGFP (mEGFP). Эта клеточная линия продуцировала CAV1-mEGFP гомогенно на уровнях, сходных с уровнем эндогенного CAV1, что приводило к умеренной сверхэкспрессии (фиг. S1 A). С помощью флуоресцентной микроскопии CAV1-mEGFP наблюдали как знакомые пятна субразрешения на плазматической мембране, соответствующие кавеолам (), и как диффузное окрашивание комплекса Гольджи.

Несобранный кавеолин в плазматической мембране. (A и B) Клетки CV1-CAV1-mEGFP не обрабатывали (A) или обрабатывали 5 мкг / мл U18666A в течение 16 часов (B), фиксировали и просматривали с помощью конфокальной микроскопии. Обработка U18666A привела к некавеолярному пулу CAV1 в плазматической мембране. (справа) На вставках показаны увеличенные области, выделенные рамкой. (C) FRAP-анализ некавеолярного поверхностного пула CAV1. Квадраты размером 4 × 4 мкм подвергали фотообесцвечиванию на периферии либо клеток CV1-CAV1-mEGFP (5 мкг / мл U18666A, обработанных в течение 16 часов [ n = 10 клеток]; и необработанных [ n = 5 клеток]), либо линия клеток CV1, стабильно экспрессирующая GFP-GPI ( n = 15 клеток).Планки погрешностей указывают среднее значение ± SEM. (D) Клетки CV1, предварительно обработанные 5 мкг / мл U18666A (16 ч), трансфицировали CAV1-mEGFP и визуализировали после переноса Гольджи с помощью покадровой визуализации TIR-FM (1 Гц). Мимолетное поле было отрегулировано таким образом, что плазматическая мембрана и часть Гольджи были освещены. Видны трубчатые носители, прибывающие на поверхность и высвобождающие CAV1-mEGFP при слиянии с плазматической мембраной. Обратите внимание, что CAV1-mEGFP распространился латерально, и не осталось кавеолярных пятен (см. Видео 1).(вверху) На вставках показано увеличение области, выделенной рамкой. (E – G) Обработка клеток CV1-CAV1-mEGFP 5 мкг / мл U18666A (16 ч) или сверхэкспрессия CAV1-mEGFP в клетках CV1 (16 ч) индуцировали несобранный CAV1 в плазматической мембране и нацеливание CAV1-mEGFP на Lamp1- положительный LE (единичные конфокальные срезы). (внизу) На вставках показаны увеличенные области соответствующих рамок. Стрелки указывают на Lamp1-положительный LE, что указывает на отсутствие (E) или присутствие (F и G) совместной локализации с CAV1-mEGFP. Штанги: (B, D [внизу] и E – G) 10 мкм; (D [вверху]) 2 мкм.

Чтобы снизить уровень холестерина в плазматической мембране и комплексе Гольджи, мы использовали U18666A, амфифильный амин, который ингибирует синтез холестерина и нарушает транспорт холестерина. Он вызывает накопление холестерина в набухшем LE / LYS, тем самым истощая холестерин в других местах (Cubells et al., 2007). CAV1-mEGFP в плазматической мембране клеток CV1, обработанных U18666A, был преимущественно равномерно распределен только с несколькими определенными пятнами, характерными для кавеол (). В соответствии с отсутствием кавеол, анализ FRAP показал, что CAV1-mEGFP в плазматической мембране был значительно более подвижным, чем в необработанных клетках ().В нормальных условиях кавеолы ​​стабильны и неподвижны, если не активированы (Thomsen et al., 2002; Tagawa et al., 2005).

Произошел ли несобранный CAV1 из кавеол плазматической мембраны или из-за дефекта сборки кавеол? Мы провели флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения (TIR) ​​(TIR-FM) в живых клетках, чтобы различить эти возможности. В контрольных клетках кавеолярные каркасы прибывают к плазматической мембране от Гольджи в предварительно собранной форме в везикулярных носителях, отличных от тех, которые используются большинством других мембранных грузов (Tagawa et al., 2005; Hayer et al., 2010). Когда везикулы сливаются с плазматической мембраной, CAV1 не диффундирует, а сохраняется в виде неподвижных плотных пятен. То, что транспорт CAV1-mEGFP отличался в клетках CV1, предварительно обработанных U18666A, было показано двумя наблюдениями. Во-первых, CAV1-mEGFP доставлялся к поверхности клетки в трубчатых, а не в небольших везикулярных носителях (и Video 1; Tagawa et al., 2005). Такие трубчатые носители типичны для конститутивного пути транспорта от Гольджи к плазматической мембране (Toomre et al., 1999). Во-вторых, CAV1-mEGFP быстро диспергировался от места слияния везикул латерально в окружающую плазматическую мембрану (и Видео 1). Это говорит о том, что он прибыл в разобранном или легко диссоциированном виде. Наиболее вероятным объяснением диффузного окрашивания плазматической мембраны было то, что за счет истощения холестерина сборка интактных кавеолиновых каркасов ингибировалась в комплексе Гольджи. По-видимому, несобранный или не полностью собранный CAV1 транспортировался на поверхность посредством конститутивного пути транспорта везикул, а не альтернативного пути, обычно используемого кавеолярными каркасами (Hayer et al., 2010). Хотя в видеороликах TIR-FM это не было очевидно, возможно, что разборка кавеол на плазматической мембране могла способствовать фенотипу. Ранее мы показали потерю кавеолярных пятен и усиление диффузного окрашивания CAV1, когда холестерин удаляется из плазматической мембраны с помощью метил-β-циклодекстрина (Tagawa et al., 2005).

Помимо диффузного окрашивания плазматической мембраны CAV1 в клетках, обработанных U18666A, CAV1 был обнаружен в некоторых больших набухших цитоплазматических органеллах, которые ингибитор индуцировал в клетках.Конфокальная микроскопия показала, что они были положительными для маркера поздней эндосомной / лизосомной лампы1 (). Они были разбросаны по цитоплазме и имели вид кавеосом, как описано в клетках, экспрессирующих CAV1-EGFP (Pelkmans et al., 2001).

Эффекты сверхэкспрессии CAV1 и подавления кавина-1

Сверхэкспрессия CAV1-mEGFP, индуцированная временной трансфекцией, обеспечила другое возмущение с аналогичными эффектами на сборку кавеол и распределение CAV1 в клетке.Когда CAV1-mEGFP временно сверхэкспрессировался и позволял накапливаться в течение 16 часов в клетках CV1, распределение CAV1 показало, в дополнение к равномерной флуоресценции в плазматической мембране, накопление метки в комплексе Гольджи и в Lamp1-положительном LE / LYS. (). Совместная сверхэкспрессия cavin-1 с CAV1 не изменила этот эффект (рис. S1 C).

Важно отметить, что через несколько часов после трансфекции конструкциями CAV1 большая часть экспрессируемого CAV1 уже локализовалась в некавеолярном поверхностном пуле и в эндосомных органеллах; я.е. их локализация отличалась от наблюдаемой для эндогенного CAV1 в контрольных клетках. Таким образом, временно сверхэкспрессируемый CAV1 не является подходящим маркером для кавеол после определенного времени экспрессии. Степень неправильной локализации также зависела от типа клеток и метода трансфекции. Например, после трансфекции методами электропорации или трансфекции на основе липидов (см. Материалы и методы) экспрессии в течение 4–5 часов было достаточно, чтобы показать неправильную локализацию в клетках CV1. Когда была необходима экспрессия конструкций CAV1, как это было при визуализации CAV1 в живых клетках, было лучше использовать клеточные линии, стабильно экспрессирующие конструкции CAV1.Уровень экспрессии был ниже, и распределение CAV1 в целом соответствовало тому, которое наблюдалось для эндогенного CAV1 в контрольных клетках.

Третья манипуляция сборки CAV1 касается cavin-1, другого важного компонента кавеолярной оболочки. Поскольку нокдаун cavin-1 с помощью siRNA вызывает сопутствующее подавление эндогенного CAV1 (Hill et al., 2008; Hansen et al., 2009; Hayer et al., 2010), siRNA, нацеленная на cavin-1, была трансфицирована в HeLa. клетки, стабильно экспрессирующие CAV1-мономерный RFP (mRFP; HeLa-CAV1-mRFP).Это привело к эффективному нокдауну cavin-1 с лишь частичной потерей экспрессии CAV1-mRFP (). CAV1-mRFP теперь присутствовал в виде однородного пула в плазматической мембране и в цитоплазматических вакуолях, которые можно было окрашивать LysoTracker, маркером для LE / LYS (). Кроме того, центрифугирование экстрактов HeLa-CAV1-mRFP в градиенте скорости сахарозы показало, что нокдаун кавина-1 привел к почти полной потере комплексов 70S CAV1, что согласуется с наблюдаемым перераспределением CAV1-mRFP из кавеолярного в некавеолярный поверхностный пул состоит из комплексов 8S ().По-видимому, CAV1 в вакуолях также присутствует в виде комплексов 8S. Поскольку cavin-1 не нужен для сборки кавеолинового каркаса в комплексе Golgi (Hayer et al., 2010), эффект нокдауна cavin-1, скорее всего, объясняется нестабильностью собранных кавеолярных каркасов в отсутствие кавинов.

Нокдаун Кавин-1. (A) Нокдаун Cavin-1 в клетках HeLa-CAV1-mRFP вызвал почти полное перераспределение собранного 70S-CAV1 в несобранный 8S-CAV1, как было определено центрифугированием в градиенте скорости сахарозы.(B и C) Клетки HeLa-CAV1-mRFP, обработанные контрольной siRNA (B) или siRNA, нацеленной на cavin-1 (C), загружали 100 нМ LysoTracker (зеленый) в течение 1 ч и визуализировали вживую с помощью конфокальной микроскопии. Нокдаун Cavin-1 вызывал потерю кавеолярных пятен в плазматической мембране и накопление CAV1-mRFP в кислых, LysoTracker-положительных органеллах. (B и C, внизу) На вставках показаны увеличенные области, выделенные рамкой. Кляксы и изображения представляют не менее трех независимых экспериментов. Прутки, 10 мкм.

В совокупности результаты показали, что вмешательство в сборку кавеол приводит к появлению несобранного, быстро диффундирующего пула кавеолинов в плазматической мембране, вероятно, представляющих комплексы 8S.Кроме того, CAV1 накапливается в LE / LYS, где он не обнаруживается при нормальных условиях. Истощение холестерина, сверхэкспрессия CAV1 и молчание cavin-1 имели сходные эффекты.

Подкисление необходимо для деградации CAV1

Для определения периода полужизни CAV1 мы использовали метаболическое мечение [ ³⁵ S] Cys / Met и метод отслеживания импульсов. Количество меченого CAV1 определяли в разное время преследования с использованием иммунопреципитации с антителом против CAV1 (N20), SDS-PAGE и авторадиографии.В нормальных условиях эндогенный CAV1 оказался чрезвычайно долгоживущим белком в клетках CV1 и HeLa. Период полураспада был намного больше 36 часов (и не показан). Это согласуется со стабильностью, продемонстрированной для кавеолярных доменов в плазматической мембране клеток (Thomsen et al., 2002; Tagawa et al., 2005). Однако временно сверхэкспрессированный CAV1-HA разлагался с гораздо большей скоростью, и мы могли оценить его период полураспада до 13,6 ч ().

Деградация CAV1 требует подкисления эндосом. (A) Динамика деградации эндогенного CAV1 и временно трансфицированного CAV1-HA в клетках CV1, как определено в эксперименте с отслеживанием импульсов (см. Материалы и методы). t _1/2 CAV1-HA составило 13,6 часа, как определено экспоненциальным приближением к точкам данных из n = 3 независимых эксперимента. Эндогенный CAV1 разлагался намного медленнее ( t _1/2 > 36 часов). (B) Разложение CAV1-HA ингибировалось 0,2 мкМ BafA и 20 мМ NH ₄ Cl, которые нейтрализуют закисление эндосом, и 10 мкМ MG132, ингибитором системы убиквитин-протеасома.Планки погрешностей указывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 3-5 независимых экспериментов). (C) Обработка клеток HeLa-CAV1-mRFP BafA, NH ₄ Cl или MG132 вызвала накопление CAV1-mRFP в эндосомных органеллах. Отдельные конфокальные секции живых клеток, фокус на перинуклеарные эндосомы. На вставках показаны увеличенные области, выделенные рамкой. Прутки, 10 мкм.

Более короткий период полужизни сверхэкспрессированного CAV1-HA позволил нам изучить путь деградации с использованием ингибиторов. Разложение CAV1-HA полностью ингибировалось бафиломицином A ₁ (BafA) и NH ₄ Cl, которые ингибируют лизосомную деградацию за счет повышения pH просвета ().Ингибитор протеасом MG132 оказывает частичное действие, что согласуется с косвенной ролью, описанной для протеасом в созревании эндосом и лизосомной деградации рецептора EGF (Longva et al., 2002). U18666A и лейпептин практически не влияли на деградацию. В соответствии с профилем ингибитора, клетки HeLa, стабильно экспрессирующие CAV1-mRFP и обработанные BafA, NH ₄ Cl или MG132, показали повышенное накопление CAV1-mRFP в эндосомных структурах по сравнению с контрольными клетками (2).Вместе эти данные указывают на то, что CAV1 нацелен на LYS для деградации. Это также происходило в стабильно экспрессирующих клетках с нормальным внутриклеточным распределением CAV1 и лишь слегка сверхэкспрессирующими CAV1-mRFP (рис. S1 B).

CAV1 в эндо / лизосомном пути

Когда CAV1-мономерный Cherry (mCherry) временно коэкспрессировался в клетках CV1 с ​​EGFP-меченными Rab5, Rab7 или Lamp1, колокализация наблюдалась в цитоплазматических вакуолях с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии. ячейки ().Мы провели количественный анализ колокализации на основе изображений, полученных из живых клеток, коэкспрессирующих CAV1-mCherry и эндосомный маркер, меченный GFP. Всего было проанализировано ∼6 × 10 ⁴ эндосом из клеток, экспрессирующих CAV1-mCherry / EGFP-Rab5 ( n = 68), CAV1-mCherry / EGFP-Rab7 ( n = 68) и CAV1-mCherry / Лампа1-EGFP ( n = 43). Результаты показали, что из CAV1-mCherry-положительных эндосомных структур 27% совместно локализованы с EGFP-Rab5, 61% с EGFP-Rab7 и 67% с Lamp1-EGFP (и рис.S2 A). В живых клетках CAV1-mCherry совместно локализуется с EGFP-Rab5 в ограничивающей мембране ранних эндосом (EE), тогда как в LE / LYS, положительных по EGFP-Rab7 или Lamp1-EGFP, он в основном присутствует в просвете. Следовательно, LE / LYS выглядели как красные (CAV1-mCherry) пятна с зеленой (EGFP-Rab7 и Lamp1-EGFP) границей (). Поскольку CAV1 является мембранным белком, он, скорее всего, был изолирован в ILV, заполняющем просвет LE / LYS. Эти результаты показали, что CAV1-mCherry не только достигал ранних эндосомных компартментов, но и продолжал путь деградации эндоцитарного пути с накоплением в ILV LE / LYS.

CAV1 и cavin-1 в эндосомном пути. (A – C) CAV1-mCherry локализован на Rab5-положительном EE и на Rab7- и Lamp1-положительном LE / LYS. Отдельные конфокальные срезы фиксированных (A) или живых (B и C) клеток получали через 12 ч после трансфекции. (внизу) На вставках показаны увеличенные области, выделенные рамкой. (D) Увеличенные изображения отдельных органелл. В EE CAV1-mCherry присутствовал в ограничивающих мембранах, а в LE / LYS — в просвете органелл. (E и F) Cavin-1-mCherry локализован на Rab5-положительном EE, но не на Rab7-положительном LE.Cavin-1-mCherry коэкспрессировался с GFP-меченными эндосомными производителями и CAV1-HA (не изображен), а изображения были получены через 12 часов после трансфекции из живых клеток с использованием установки эпифлуоресценции. (внизу) На вставках показаны увеличенные области, выделенные рамкой. Стрелки указывают на эндосомные органеллы, указывая на присутствие (A – C и E) или отсутствие (F) совместной локализации между маркерами. (G) Анализ совместной локализации эндосомных структур CAV1-mCherry с эндосомными маркерами. Долю эндосом CAV1-mCherry на клетку, совместно локализующуюся с EGFP-Rab5 ( n = 68 клеток), EGFP-Rab7 ( n = 68 клеток) и Lamp1-EGFP ( n = 43 клетки), определяли как подробно в Материалы и методы (рис.S2 A) из изображений, полученных от живых клеток с использованием установки эпифлуоресценции. На прямоугольных диаграммах показаны медианы, нижний и верхний квартили (линия и прямоугольник), 10-й и 90-й процентили (усы) и выбросы (•). Штанги: (A – C, E и F) 10 мкм; (D) 1 мкм.

Cavin-1 ассоциирует с полностью собранными кавеолярными каркасами в плазматической мембране, но не с биосинтетическими промежуточными продуктами или несобранными формами CAV1 (Hill et al., 2008; Hayer et al., 2010). Поэтому мы использовали cavin-1 в качестве сенсора для оценки состояния сборки CAV1 в эндосомном пути.Когда коэкспрессируется с EGFP-Rab5 и CAV1-HA, cavin-1-mCherry, как было обнаружено, колокализуется с CAV1 в EE, указывая тем самым, что ранний эндосомный CAV1, по крайней мере частично, все еще собирается в кавеолярных каркасах (). Напротив, когда коэкспрессируется с EGFP-Rab7 и CAV1-HA, cavin-1-mCherry не колокализируется с поздним эндосомным маркером, скорее всего потому, что каркасы CAV1 были разобраны до достижения LE / LYS (). Следовательно, разборка кавеолярных каркасов может быть связана с прогрессированием CAV1 в эндолизосомном пути.

Визуализация CAV1 в LE / LYS в фиксированных клетках оказалась проблематичной из-за плохой фиксации этих органелл в клетках CV1 с ​​различными фиксаторами на основе формальдегида (FA). Наиболее отчетливо это наблюдалось при наблюдении за процессом под микроскопом; большая часть Lamp1-EGFP-положительных LE / LYS теряет CAV1-mCherry после добавления FA (рис. S2B и видео 2). Просветной CAV1-mCherry был выпущен в окружающую цитоплазму, оставив после себя пустой Lamp1-EGFP, помеченный как «призрак».Ограничивающие мембраны LE / LYS, по-видимому, были закреплены должным образом, но содержимое многих вакуолей было потеряно. Как следствие, мы избегали фиксации при визуализации поздних компартментов эндоцитарного пути и вместо этого использовали микроскопию живых клеток с флуоресцентно мечеными белками и грузом.

CAV1 в кислом просвете LE / LYS

CAV1 встроен в цитоплазматический листок мембран, причем оба конца N и C обращены к цитозолю. Чтобы разложиться, он должен подвергаться воздействию гидролаз в просвете LE / LYS.По аналогии с деградацией рецепторов клеточной поверхности это может происходить путем включения во внутрь отрастающих пузырьков во время образования ILV с последующим лизисом или деградацией ILV в LYS.

Чтобы проверить, подвергался ли CAV1 воздействию кислого просвета LE / LYS, мы использовали разницу в чувствительности pH флуоресценции mCherry и EGFP. Хотя флуоресценция EGFP гасится при значениях pH <6 (pK _a 6,0), mCherry остается ярко флуоресцентной в кислой среде вплоть до pH 4.5 (pK _a <4,5; Kneen et al., 1998; Shaner et al., 2004; Shaner et al., 2005). Значение pH колеблется от 6,0 до 6,5 в EE и от 5,5 до LE до 4,7 в LYS (Kielian, Cohn, 1982; Zen et al., 1992).

Было показано, что за подкислением эндосом можно следить, используя белковый груз с тандемным тегом, который содержит как EGFP, так и mCherry (Pankiv et al., 2007). Флуоресценция EGFP гасится в LYS, тогда как mCherry — нет. Следуя аналогичной стратегии, мы коэкспрессировали CAV1-mEGFP и CAV1-mCherry в клетках CV1 и выполнили конфокальную визуализацию живых клеток.Кавеолярные пятна на плазматической мембране и в ограничивающей мембране эндосом были желтыми, как и ожидалось от смешанной флуоресценции, испускаемой CAV1-mEGFP и -mCherry (пунктирная вставка). Диффузное окрашивание плазматической мембраны, представляющей свободный CAV1, также было желтым.

CAV1 подвергается воздействию кислого просвета LE / LYS. (A) CAV1-mEGFP и CAV1-mCherry совместно локализованы в кавеолярных пятнах плазматической мембраны (пунктирная вставка, контраст скорректирован), но не во многих внутриклеточных органеллах при визуализации вживую.(B) Клетки CV1, экспрессирующие CAV1-mCherry, окрашивали 100 нМ LysoTracker (зеленый) в течение 1 ч и визуализировали вживую для идентификации кислых органелл. Большинство кислых органелл оказались положительными на CAV1-mCherry. (C) Совместная локализация между CAV1-mEGFP и CAV1-mCherry в эндосомах восстанавливалась обработкой клеток 0,2 мкМ BafA (12 ч), что указывает на кислотное тушение флуоресценции mEGFP. (A – C) Отдельные конфокальные срезы живых клеток. (вверху) На вставках показаны увеличенные области, выделенные рамкой. (D и E) Покадровая визуализация живых клеток клеток CV1, коэкспрессирующих CAV1-mEGFP и CAV1-mCherry, для мониторинга кислотозависимого тушения флуоресценции CAV1-mEGFP во время созревания эндосомы.(D) Эндосома, изначально положительная для CAV1-mEGFP и CAV1-mCherry, отслеживалась в течение 42 минут, как показано в E, и профили интенсивности флуоресценции были нанесены на график в зависимости от времени. Флуоресценция CAV1-mEGFP со временем затухала, тогда как флуоресценция CAV1-mCherry была стабильной. Чтобы исключить фотообесцвечивание mEGFP, измеряли и наносили на график общую перинуклеарную флуоресценцию mEGFP (E, синий пунктирный контур; D, профиль интенсивности). Серии покадровой съемки записывались с эпифлуоресцентным освещением с частотой 0,2 Гц. (F) Кадры CAV1-mEGFP и CAV1-mCherry-положительной эндосомы, отслеживаемые в D (видео 3).Штанги: (A – C) 10 мкм; (E) 5 мкм; (F) 0,5 мкм.

Однако многие цитоплазматические вакуоли имели ярко-красный цвет mCherry, соответствующий избирательному тушению mEGFP (Pankiv et al., 2007). Чтобы проверить, вызвано ли это низким pH, клетки, экспрессирующие CAV1-mCherry, загружали 100 нМ LysoTracker green в течение 1 часа и визуализировали вживую. Большинство, если не все кислые органеллы, помеченные LysoTracker, были положительными на CAV1-mCherry (). Когда клетки, коэкспрессирующие CAV1-mCherry и CAV1-mEGFP, обрабатывали 0,2 мкМ BafA (12 ч) для нейтрализации рН просвета, все вакуоли были флуоресцентными как в каналах mCherry, так и в mEGFP ().Аналогичные результаты были получены при использовании 20 мМ NH ₄ Cl (12 ч) вместо BafA (неопубликованные данные).

Поскольку mEGFP и mCherry были помечены на C-конце CAV1, топология диктовала, что они должны находиться внутри ILV. Следовательно, потеря зеленой флуоресценции должна была включать лизис ILV и подвергать внутреннюю часть этих пузырьков воздействию низкого pH. Чтобы проследить этот процесс в отдельных эндосомах, клетки, коэкспрессирующие CAV1-mEGFP и CAV1-mCherry, визуализировали вживую в течение 45 минут с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.Было замечено, что многочисленные эндосомы, изначально желтые, теряли свою зеленую флуоресценцию mEGFP со временем, тогда как красная флуоресценция mCherry оставалась постоянной (и видео 3). Важно отметить, что потеря флуоресценции mEGFP не была вызвана фотообесцвечиванием, поскольку общая перинуклеарная флуоресценция mEGFP оставалась постоянной (). Таким образом, использование конструкций CAV1 обеспечило метод отслеживания поздних стадий созревания отдельных эндосом и мультивезикулярных тел в живых клетках.

Вместе наши данные свидетельствуют в пользу модели, в которой CAV1, присутствующий в эндосомах, секвестрируется в ILV.Когда эндосомы созревали и сливались с LYS, он подвергался воздействию кислого просвета и в конечном итоге деградировал. Сверхэкспрессия CAV1 и отсутствие эффективной сборки кавеол усиливали этот процесс, так что CAV1 стал легко обнаруживаемым компонентом в просвете LE / LYS.

CAV1 убиквитинируется, и убиквитинирование необходимо для деградации

Нацеливание мембранных белков на ILV обычно контролируется добавлением убиквитиновых групп к их цитозольному домену (Raiborg and Stenmark, 2009).Чтобы определить, был ли CAV1 убиквитинирован, меченый HA CAV1 был экспрессирован в клетках HEK293 и иммунопреципитирован из экстрактов с использованием антитела против CAV1 (N20). Вестерн-блот-анализ с использованием антитела против НА выявил присутствие множества более медленно мигрирующих видов CAV1 в дополнение к основной полосе CAV1-HA (). Зондирование эквивалентных мембран с помощью антиубиквитина (FK2) для обнаружения убиквитина выявило несколько соответствующих полос ().

CAV1 убиквитинирован. (A) Клетки HEK293 трансфицировали CAV1-HA или CAV1-K * R-HA, и CAV1 иммунопреципитировали с использованием антитела против CAV1 (N20).Зондирование блотов с антителом против убиквитина (FK2) выявило убиквитинированные виды CAV1 в иммунопреципитатах, полученных из клеток, экспрессирующих CAV1-HA дикого типа, но не из клеток, экспрессирующих мутантный лизин-нуль-CAV1-K * R-HA. Миграция стандартов молекулярной массы указывается в килодальтонах. (B) Анализ отслеживания импульсов показал, что оборот CAV1-K * R-HA был замедлен на 47% по сравнению с CAV1 дикого типа (CAV1-HA). Планки погрешностей указывают среднее значение ± стандартное отклонение для трех образцов, собранных за два экспериментальных дня.(C) Окрашивание убиквитином накапливалось и совместно локализовалось с сверхэкспрессированным CAV1-HA в Rab5-положительном EE клеток CV1. (D – F) Накопление убиквитина в EE не наблюдалось в клетках, трансфицированных лизин-нулевым мутантом CAV1-K * R-HA (D), в нетрансфицированных клетках (E) или в клетках, трансфицированных mRFP-Rab5 / EGFP. -Раб7 (F). Показаны единичные конфокальные срезы фиксированных клеток. (C – F, внизу) На вставках показаны увеличенные области, выделенные рамкой. Прутки, 10 мкм.

Чтобы подтвердить, что CAV1 был убиквитинированным видом, наблюдаемым в экспериментах с понижением, мы сконструировали версию CAV1, которая больше не могла быть убиквитинирована в результате мутации всех 12 лизинов в аргинины (CAV1-K * R; рис.S3 A). При экспрессии в клетках CV1, GFP-меченная форма мутанта легко достигала плазматической мембраны, где ее можно было обнаружить в виде пятен субразрешения, типичных для кавеол (рис. S3 B). Успешная сборка кавеол мутанта была также подтверждена центрифугированием на скорости сахарозы лизатов, полученных из клеток, экспрессирующих GFP- или HA-меченный CAV1-K * R (Fig. S3 C; Hayer et al., 2010). Когда CAV1-K * R-HA использовался в эксперименте с понижением уровня, убиквитинированных видов не наблюдалось, что подтверждает, что CAV1 действительно убиквитинирован.Было также обнаружено, что CAV1 убиквитинируется при иммунопреципитации из лизатов клеток HEK293, коэкспрессирующих CAV1-myc и HA-убиквитин, как в нативных, так и в денатурирующих условиях, чтобы исключить нековалентную ассоциацию конъюгатов убиквитина (фиг. S3 D).

Чтобы определить, присутствует ли убиквитинированный CAV1 в EE, клетки CV1, коэкспрессирующие CAV1-HA и EGFP-Rab5, окрашивали как антителами против CAV1 (N20), так и против убиквитина (FK2). Конфокальная микроскопия выявила обширную совместную локализацию между CAV1 и убиквитином в Rab5-положительных EE ().Поразительно, что накопление сигнала против убиквитина наблюдалось только тогда, когда клетки были трансфицированы CAV1 дикого типа, но не мутантом CAV1-K * R () с нулевым лизином. Нетрансфицированные клетки или клетки, трансфицированные только меченым Rab5 / Rab7, демонстрировали типичное гомогенное распределение убиквитина в цитоплазме и ядре (). Следовательно, убиквитинированный CAV1 обнаруживался только тогда, когда большое количество CAV1 присутствовало в эндолизосомном пути.

Для непосредственного рассмотрения значимости убиквитинирования для деградации CAV1 мы проверили, влияет ли лизин-нулевая мутация на кинетику деградации CAV1.Действительно, когда CAV1-K * R-HA тестировался в экспериментах с импульсной погоней, деградация мутанта была снижена на 47% по сравнению с CAV1-HA дикого типа, демонстрируя, что убиквитинирование важно для деградации CAV1 ().

В совокупности результаты показали, что CAV1 убиквитинирован. В клетках, сверхэкспрессирующих CAV1, убиквитинированные формы накапливаются в Rab5-положительных EE. Убиквитинирование было особенно необходимо для деградации CAV1, потому что мутант CAV1, который не мог быть убиквитинирован, демонстрировал ослабленную кинетику деградации.

Компоненты убиквитинирования и ESCRT Hrs и Tsg101 необходимы для нацеливания ILV на CAV1

Если убиквитинирование требовалось для нацеливания ILV на CAV1, ожидалось, что истощение свободного убиквитина путем обработки клеток ингибитором протеасом MG132 предотвратит нацеливание на ILV и экспозицию CAV1 в кислый просвет эндосом. Чтобы устранить эту возможность, мы изменили нашу стратегию двойного тегирования, при которой CAV1-mCherry, но не CAV1-mEGFP, был виден в кислых LE / LYS, построив CAV1, помеченный mEGFP и mCherry на его конце C (тандемный тег, CAV1-тандем).Хотя тандемная метка не влияет на субклеточную локализацию CAV1, она обеспечивает более высокую интенсивность флуоресценции и более постоянное соотношение сигнала GFP / mCherry, чем совместная экспрессия индивидуально меченой CAV1. Присутствие красных эндосом использовалось в качестве считывания для успешного нацеливания тандема CAV1 на кислый просвет эндосом.

Как и ожидалось, многие эндосомы были красными в контрольных клетках, тогда как эндосомы были красными и зелеными в клетках, обработанных NH ₄ Cl (). Поразительно, что в присутствии 10 мкМ MG132 (12 ч) большинство эндосом оставались как красными, так и зелеными, что согласуется с убиквитин- или протеасомозависимым включением CAV1 в ВЛК во время позднего созревания эндосом (), но также и со сниженной скоростью. деградации CAV1, наблюдаемой в присутствии MG132 ().

Убиквитинирование CAV1 и механизм ESCRT необходимы для нацеливания на ILV. (A) В клетках CV1, экспрессирующих CAV1 с mEGFP-mCherry (тандем), флуоресценция mCherry не перекрывалась с флуоресценцией mEGFP во многих эндосомных структурах, что указывает на кислотозависимое тушение mEGFP в LE / LYS (). (B и C) Обработка клеток 20 мМ NH ₄ Cl (B) или 10 мкМ MG132 (C) восстанавливала флуоресценцию mEGFP, что согласуется с нейтрализованным pH просвета и дефектами нацеливания на ILV, соответственно.Клетки HeLa, предварительно обработанные в течение 48 часов контрольной siRNA (D) или siRNA, нацеленной на компоненты ESCRT Hrs и Tsg101 (E; двойной нокдаун), трансфицировали тандемом CAV1 в течение 12 часов и просматривали вживую с помощью конфокальной микроскопии. Присутствие желтых эндосом после нокдауна Hrs и Tsg101 показало участие аппарата ESCRT в нацеливании ILV на CAV1. (F) Вестерн-блоттинг показал успешный нокдаун Hrs и Tsg101. (A – E) Показаны отдельные конфокальные срезы живых клеток. (внизу) На вставках показаны увеличенные области, выделенные рамкой.Прутки, 10 мкм.

Сходная стратегия была применена для проверки участия аппарата ESCRT в нацеливании ILV на CAV1. Клетки HeLa, предварительно обработанные миРНК (48 ч), нацеленные на компоненты ESCRT Hrs и Tsg101 или контрольную миРНК, трансфицировали тандемом CAV1, и эндосомальный CAV1 визуализировали с помощью конфокальной микроскопии. Первоначальные эксперименты, в которых индивидуально подавляли Hrs или Tsg101, не дали сильного фенотипа (неопубликованные данные). Однако после двойного нокдауна и Hrs, и Tsg101, серьезные дефекты в нацеливании ILV на CAV1-тандем наблюдались с CAV1-тандем-положительными эндосомами, оставшимися как красными, так и зелеными ().Вместе не только убиквитинируется CAV1 и убиквитинирование необходимо для его деградации, но убиквитин служит сигналом сортировки для нацеливания ILV на CAV1, процесса, который требует компонентов ESCRT Hrs и Tsg101.

Обсуждение

Кавеолы ​​в плазматической мембране представляют собой стабильные структуры, а CAV1, соответственно, является чрезвычайно долгоживущим белком. Однако, когда сборка кавеол была нарушена, мы обнаружили, что доля несобранного CAV1 в клетках была увеличена, и оборот резко увеличился.Белок был нацелен на эндосомы, убиквитинирован, секвестрирован в ILV с помощью аппарата ESCRT и разложился в LYS (). Результаты позволили нам объяснить наблюдения, касающиеся жизненного цикла CAV1 и природы богатых кавеолином вакуолей, называемых кавеосомами, ранее описанных после сверхэкспрессии CAV1 нашей группой.

Модель разборки кавеол и деградации CAV1. Разборка включает высвобождение кавина-1 из интактной кавеолы ​​с последующей диссоциацией дестабилизированного кавеолярного каркаса 70S на кавеолярные комплексы 8S.Это может происходить в EE после кавеолярного эндоцитоза или в плазматической мембране (PM), откуда разобранный CAV1 доставляется в EE в качестве эндоцитарного груза. Несобранный CAV1 может также возникать, когда сборка кавеолярных каркасов в Golgi нарушена и CAV1 поступает в плазматическую мембрану в форме 8S комплексов. В эндосомах убиквитинированные кавеолярные комплексы 8S распознаются аппаратом ESCRT и направляются на ILV, обращенный к просвету. После лизиса ILV в LYS, CAV1 подвергается воздействию кислого вакуолярного pH и разрушается протеолитическим расщеплением.

Одним из возмущений, используемых для увеличения оборота CAV1, действительно была его избыточная экспрессия. По-видимому, переизбыток этого кавеолярного компонента привел к насыщению сборки кавеол в комплексе Гольджи, образованию быстро диффундирующего пула свободного CAV1 в плазматической мембране и падению t _1/2 с> 36 часов для эндогенного до 13,6 ч для сверхэкспрессированного CAV1. Молчание CAVIN-1 привело к аналогичному эффекту с почти полной потерей 70S кавеолярных каркасов в клетке, накоплением промежуточных продуктов 8S кавеолина и, опять же, диффузным распределением CAV1 в плазматической мембране.Снижение клеточного холестерина с использованием U18666A также резко увеличивало уровень свободного, быстро диффундирующего CAV1 в плазматическую мембрану за счет кавеол. Холестерин необходим для сборки кавеол в Гольджи; он связывается непосредственно с кавеолинами и служит важным компонентом микродомена мембран, подобных липидным плотам (Murata et al., 1995).

Помимо увеличения свободного CAV1 в плазматической мембране, эти три условия вызывали накопление CAV1 в Lamp1-положительных эндолизосомных вакуолях в цитоплазме.Это указывает на то, что избыток несобранного CAV1 нацелен на деградационную ветвь пути эндоцитоза. Ингибирование NH ₄ Cl и BafA подтвердило, что разложение происходит в LYS.

В нормальных, невозмущенных условиях CAV1 в плазматической мембране локализуется в кавеолах без детектируемого свободного пула. С помощью иммунофлуоресценции и визуализации живых клеток было показано, что некоторое количество CAV1 также находится в EE, где он образует определенные домены (Pol et al., 2000; Pelkmans et al., 2004). Связывание cavin-1 с ранним эндосомным CAV1 указывает на то, что CAV1 в EE обладает, по крайней мере частично, зрелой собранной конформацией.

Непрямая иммунофлуоресценция не показала присутствие эндогенного CAV1 в LE или LYS, возможно, не только из-за его низкой скорости обмена и его низкого содержания в этих органеллах, но также из-за артефакта фиксации, который затрудняет демонстрацию присутствия антигенов. в ILV клеток CV1. Хотя EE были должным образом зафиксированы с использованием различных фиксаторов на основе FA, большинство органелл, содержащих Lamp1, разорвалось во время фиксации и высвободило свое содержимое, включая CAV1, в цитоплазму.Следовательно, для анализа поздних эндосомных компартментов визуализация живых клеток была более надежной, чем иммунофлуоресцентная микроскопия, но могла выполняться только с помеченными формами CAV1 и эндосомными маркерами. В невозмущенных, стабильных клеточных линиях, экспрессирующих флуоресцентно меченый CAV1 на относительно низких уровнях, не наблюдалось окрашивания в LE / LYS. Напротив, временная сверхэкспрессия флуоресцентного CAV1 приводит к быстрому накоплению в Rab5-, Rab7- и Lamp1-положительных органеллах.

Электронная микроскопия с использованием мечения иммунным золотом в клетках HepG2 ранее показала, что эндогенный CAV1 может быть обнаружен в мультивезикулярных тельцах (Botos et al., 2008) и что стимуляция кавеолярного эндоцитоза альбумином увеличивает нацеливание CAV1 на этот компартмент, подтверждая корреляцию между кавеолярным транспортом и лизосомной деградацией CAV1. То, что деградация эндогенного CAV1 происходит в LYS, также подтверждается наблюдениями, что siRNA-опосредованный нокдаун флотилина-1 и кавина-1, а также обработка клеток PDGF вызывает ускоренную деградацию CAV1 и что это чувствительно к ингибиторам лизосомная деградация (Peterson et al., 2003; Hill et al., 2008; Васильева и др., 2009).

Когда CAV1 был сверхэкспрессирован, в EE наблюдался четкий сигнал убиквитина. Без сверхэкспрессии CAV1 или после сверхэкспрессии мутанта по лизину CAV1 такой сигнал отсутствовал. Биохимический анализ подтвердил, что большая часть CAV1, присутствующего в клетках, на самом деле поли- или моноубиквитинирована и что убиквитинирование важно для ускоренной деградации CAV1. Сходным образом истощение свободного убиквитина с помощью MG132 и нокдаун siRNA Hrs и Tsg101 показали, что убиквитин и аппарат ESCRT необходимы для нацеливания CAV1 на ILV.Перед закрытием ILV расщепляемые белки груза обычно деубиквитинируются. Таким образом происходит избирательное нацеливание активированного рецептора EGF и других мембранных белков для разрушения в LYS (Raiborg and Stenmark, 2009). Если рассматривать живые клетки, то CAV1, присутствующий в Rab7- и Lamp1-позитивных LE / LYS, на самом деле в основном локализован в просвете вакуолей, а не в ограничивающей мембране, тогда как в EE его локализация все еще совпадает с Rab5 в ограничивающей мембране. мембрана.

Тушение флуоресценции CAV1-mEGFP в LE / LYS, наблюдаемое в живых клетках, показало, что CAV1 в ILV подвергается воздействию низкого pH.Учитывая топологию мембраны CAV1 и расположение GFP на С-конце, этот сдвиг подразумевает, что защита GFP с помощью мембраны ILV была потеряна и GFP подвергался воздействию pH <6,0. После экспрессии CAV1, меченного mEGFP и mCherry по отдельности или в тандеме, мы могли проследить созревание отдельных эндосом в живых клетках, наблюдая переход от желтой к красной флуоресценции. Такая стратегия двойной метки может быть широко использована в исследованиях образования ILV, подкисления и созревания LE / LYS в живых клетках.

Ранние эксперименты в нашей лаборатории показали, что во время проникновения в CAV1-EGFP-экспрессирующие клетки CV1 входящий SV40 транзитом от плазматической мембраны к ER попадает в богатые CAV1 внутриклеточные органеллы (Pelkmans et al., 2001). Эти органеллы были названы кавеосомами, потому что они, по-видимому, отличаются от нормальных эндосом. Они характеризовались обильным присутствием CAV1-EGFP, они не содержали эндосомальных маркеров, а их рН просвета был нейтральным (Pelkmans et al., 2001).

Впоследствии мы обнаружили, что поступающие вирусы действительно проходят через EE и LE на пути к ER, где и происходит проникновение (неопубликованные данные).Ввиду новых данных SV40 и результатов, представленных в этом исследовании, мы больше не рассматриваем кавеосомы, независимые органеллы. В нормальных условиях мы обнаружили, что эндогенный CAV1 может наблюдаться в EE, но, как правило, не в LE / LYS. Однако при сильной сверхэкспрессии, как это было в наших исследованиях, описывающих кавеосомы, CAV1-EGFP и другие формы CAV1 накапливались в поздних органеллах эндоцитарного пути. Они содержат маркеры ILV и LE / LYS, такие как Rab7 и Lamp1. Это маркеры, которые не тестировались в первоначальных исследованиях кавеосом.

Может быть несколько причин, по которым оригинальные исследования, описывающие кавеосомы (Pelkmans et al., 2001, 2004), пришли к выводу, что pH их просвета является нейтральным. PH органелл, содержащих CAV1, не определялся напрямую, но был выведен из измерений общего pH с использованием SV40 в качестве зонда из клеток в суспензии. Более того, анализ динамики поступления SV40 и эксперименты по вымыванию лекарств теперь показывают, что момент времени, в который измеряли pH с использованием флуоресцентного вируса в качестве pH-зонда, был выбран неудачно, потому что большая часть вируса, возможно, уже достигла ER, т.е. нейтральная среда к моменту проведения измерений (неопубликованные данные).

Электронно-микрографические срезы, показывающие структуры со многими кавеолярными доменами, скорее всего, представляют структуры, все еще связанные с плазматической мембраной (Parton and Simons, 2007; Kiss and Botos, 2009). Мы подчеркиваем, что кавеосомы, согласно нашим настоящим данным, скорее всего, являются модифицированными LE / LYS и, следовательно, частью классического пути эндоцитоза. Мы предлагаем больше не использовать термин кавеосома.

В свете наших открытий мы предполагаем, что деградация CAV1 происходит в LE / LYS после включения CAV1 в ILV с помощью комплексов ESCRT, локализованных в EE (). Деградация происходит только в том случае, если CAV1 присутствует в комплексах 8S, потому что интактные кавеолярные каркасы слишком велики для включения в ILV. Более того, чтобы распознаваться аппаратом ESCRT и секвестрироваться после деубиквитинирования в ILV, комплексы 8S должны присутствовать в EE и быть убиквитинированными. Комплексы 8S могут быть образованы следующими различными способами: (а) кавеолярные каркасы в плазматической мембране могут быть дестабилизированы, например.g., потерей кавина-1 с последующей диссоциацией на комплексы 8S и эндоцитозом этих комплексов в EE. (b) Сборка кавеолярных каркасов в комплексе Гольджи может быть нарушена, например, из-за сверхэкспрессии CAV1 или недостатка холестерина, что приводит к прибытию несобранных, свободно диффундирующих комплексов 8S к плазматической мембране с последующим эндоцитозом и доставкой в ​​EE. . (c) В отсутствие кавина-1 кавеолярные каркасы все еще могут быть собраны в комплекс Гольджи, но, будучи нестабильными, они диссоциируют на комплексы 8S вскоре после встраивания в плазматическую мембрану (Hayer et al., 2010). (d) Диссоциация кавеолярных каркасов может также происходить в EE после эндоцитоза интактных кавеолярных доменов в форме кавеолярных пузырьков и их слияния с EE. В этом случае потеря кавина-1 может привести к диссоциации эндосомных кавеолярных каркасов. Деградация кавеол — это поэтапный процесс, в котором задействовано множество компонентов. Остается определить, как разборка высокостабильного, долгоживущего кавеолярного домена регулируется убиквитинированием, кавинами и др. Клеточными факторами.

Материалы и методы

Культура клеток и трансфекции

Клетки CV1 и HeLa (Американская коллекция типовых культур) выращивали в DME (Invitrogen) с добавлением 10% FCS и 5% Glutamax (Invitrogen). Клетки HeLa, стабильно экспрессирующие CAV1-mRFP (Tagawa et al., 2005), поддерживались как клетки HeLa, но в присутствии 0,5 мг / мл G418. Клетки HEK293 выращивали как CV1, но в присутствии пенициллина / стрептомицина. Клетки CV1, стабильно экспрессирующие CAV1-mEGFP (CV1-CAV1-mEGFP), были получены с использованием родительской клеточной линии CV1-Flp-In (Invitrogen) и плазмиды CAV1-mEGFP / FRT / TO, следуя протоколу производителя для рекомбинации Flp-In ( Invitrogen).Аналогичным образом были созданы клетки CV1-GFP-GPI с использованием плазмиды GFP-GPI / FRT / TO. Обе рекомбинантные клеточные линии выращивали как клетки CV1, но в присутствии 150 мкг / мл гигромицина. Клетки CV1 трансфицировали кДНК электропорацией в соответствии с рекомендациями производителя (Nucleofector kit V; программа A24; Lonza), а клетки HEK293 трансфицировали кальциево-фосфатным методом.

Плазмидные конструкции

CAV1-mEGFP, CAV1-mCherry, CAV1-HA и cavin-1-mEGFP были описаны ранее (Hayer et al., 2010). Для создания CAV1-mEGFP / FRT / TO кодирующую последовательность для CAV1-mEGFP вырезали из плазмиды CAV1-mEGFP как фрагмент HindIII-NotI и лигировали с соответствующим образом расщепленным pcDNA5 / FRT / TO (Invitrogen). GFP-GPI / FRT / TO был создан путем субклонирования GFP-GPI из EGFP-GL-GPI (Keller et al., 2001) в pcDNA5 / FRT / TO (Invitrogen) в виде фрагмента HindIII-NotI. CAV1-тандем был сконструирован сначала путем ПЦР-амплификации mEGFP, фланкированного сайтами BamHI и AgeI, с использованием праймеров (смысловой) 5′-ATGGATCCAGTGAGCAAGGCGAGGAGC-3 ‘и (антисмысловой) 5′-ATACCGGTTTTGTACAGCTCGTCCATGCCAVI-3’ и расщепления CAMI в AgeI-CAMI. mCherry (основа pcDNA5 / FRT / TO), в результате чего получается CAV1-mEGFP-mCherry (CAV1-тандем).КДНК, кодирующая мутант CAV1 со всеми 12 лизинами, мутированными в аргинины (CAV1-K * R), была синтезирована GENEART AG в виде последовательности, фланкированной сайтами HindIII-BamHI и C-концевой меткой HA, за которой следует сайт NotI. Лигирование расщепленного HindIII-NotI- или HindIII-BamHI фрагмента в соответствующим образом расщепленные фрагменты основной цепи pmEGFP-N1 давало CAV1-K * R-HA или CAV1-K * R-mEGFP, соответственно. Cavin-1-mCherry был создан на основе cavin-1-mEGFP путем замены mEGFP на mCherry в виде фрагмента AgeI-BsrGI. EGFP-Rab5 был предоставлен M.Zerial (Институт молекулярной клеточной биологии и генетики им. Макса Планка, Дрезден, Германия), EGFP-Rab7 и Lamp1-EGFP были предоставлены Дж. Грюнбергом (Женевский университет, Женева, Швейцария), HA-убиквитин предоставлен П. Де Камилли. (Медицинская школа Йельского университета, Нью-Хейвен, Коннектикут), а CAV1-myc был предоставлен Дж. Пессином (Медицинский колледж Альберта Эйнштейна, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк). mRFP-Rab5 был описан ранее (Vonderheit and Helenius, 2005). Плазмидные конструкции, созданные в этом исследовании, будут доступны через Addgene после публикации.

Антитела и другие реагенты

Rabbit pAb anti-CAV1 (N20; sc-894), мышиное mAb против LAMP1 (sc-20011) и мышиное mAb против c-myc (9E10; sc-40) были получены из Santa Cruz Biotechnology, Inc., кроличьи pAb против PTRF (полимераза I и фактор высвобождения транскрипта; cavin-1) от Abcam (ab48824), кроличьи pAb против гигантина (PRB-114C) и mAb против HA от Covance (MMS- 101P), mAb против Hrs от Sigma-Aldrich (6D11; WH0009146M1), mAb против Tsg101 от Axxora (4A10; NB200-112), mAb против β-актина мыши от Sigma-Aldrich (AC-15; A1978), и мышиные mAb против убиквитина от Enzo Life Sciences, Inc.(FK2; BML-PW8810-0500). Кроличий анти-калнексин производился самостоятельно. Вторичные антитела для иммунофлуоресценции, конъюгированные с Alexa Fluor, и зеленый LysoTracker были получены от Invitrogen.

Центрифугирование в градиенте скорости

Центрифугирование сахарозы в градиенте скорости выполняли, как описано ранее (Hayer et al., 2010). Вкратце, клетки солюбилизировали при 25 ° C в 0,5% Triton X-100 (TX100) в TNE (20 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 100 мМ NaCl и 5 мМ EDTA) с добавлением коктейля из комплексных ингибиторов протеаз (Roche). .Постнуклеарные супернатанты загружали в 10-40% линейные градиенты сахарозы, приготовленные в 0,5% TX100 / TNE, и вращали в роторе (SW55Ti; Beckman Coulter) при 50 000 об / мин (237 020 г ) и 4 ° C в течение 255 мин. Градиентные фракции анализировали SDS-PAGE / вестерн-блоттингом.

RNAi

Олигомеры siRNA, нацеленные на PTRF / cavin-1 (SI04178496), Hrs (SI00288239) и Tsg101 (SI02655184), были приобретены у QIAGEN и трансфицированы в клетки HeLa-CAV1-mRFPe at 10 LipofMAX или HeLa Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя и как описано ранее (Hayer et al., 2010). Ненаправляющая миРНК (AllStarsNeg; QIAGEN) была использована в качестве контрольной миРНК. Клетки анализировали через 60–72 ч после трансфекции, как указано.

Метаболическое мечение, иммунопреципитация и авторадиография

На образец, 3 × 10 ⁵ клеток, экспрессирующих варианты CAV1, в течение 6 часов после электропорации или нетрансфицированные клетки CV1 сначала голодали в течение 45 минут в DME, не содержащем Cys / Met (Sigma-Aldrich ) и пульс, помеченный в течение 1 или 4 часов, соответственно, с использованием 0,2 мКи / мл [ ³⁵ S] Cys / Met Promix (NEG772007; PerkinElmer) в среде DMEM, в остальном дефицитной по Cys / Met.Клетки промывали и прогоняли в полной среде (DMEM, 10% FCS и 1% глутамакс) с добавлением 5 мМ Cys, 5 мМ Met, 50 мМ Hepes, pH 7,4 и 1 × пенициллин / стрептомицин. Для лечения лекарственными препаратами клетки CV1, экспрессирующие CAV1-HA, подвергали импульсной метке в течение 1 часа и преследовали в течение 1 часа перед добавлением лекарств (10 мМ лейпептин, 0,2 мкМ BafA в ДМСО, 20 мМ NH ₄ Cl, 5 мкг / мл U18666A, и 10 мкМ MG132 в ДМСО), чтобы гарантировать, что лекарства не препятствуют доставке меченого CAV1 к плазматической мембране. Клетки, за которыми гнались в течение указанного времени (всего 15 часов для лечения лекарствами и CAV1-K * R-HA), солюбилизировали в 500 мкл буфера RIPA (50 мМ трис-HCl, pH 7.4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% TX100, 1% дезоксихолата натрия и 0,1% SDS) с добавлением коктейля полного ингибитора протеазы (Roche) при 4 ° C. Для иммунопреципитации лизаты инкубировали 2 часа или в течение ночи при 4 ° C с 2 мкг антитела против CAV1 (N20), и комплексы выделяли с протеином G-сефарозой (GE Healthcare). Иммунопреципитаты промывали четыре раза с использованием буфера RIPA, элюировали кипячением в буфере для образцов SDS и разделяли с помощью SDS-PAGE. Меченый белок визуализировали с помощью фосфорно-визуализатора (STORM; MDS Analytical Technologies), а полосы количественно определяли с помощью ImageJ (Национальные институты здравоохранения).

Нативные и денатурирующие иммунопреципитации для обнаружения убиквитинированных CAV1

Клетки HEK293 трансфицировали CAV1-HA, CAV1-K * R-HA, пустым вектором или котрансфицировали CAV1-myc и HA-убиквитином (Ca _{3 PO 4 ) 2 метод. Через 24 часа клетки соскребали в PBS, осаждали и солюбилизировали в 250 мкл буфера для иммунопреципитации (150 мМ KCl, 50 мМ Трис, pH 7,4, 5 мМ MgCl 2 , 1% TX100, 5% глицерин и 2 мМ β -меркаптоэтанол с добавлением коктейля полного ингибитора протеазы).Для денатурирующих иммунопреципитации экстракты, приготовленные в 100 мкл буфера для иммунопреципитации, сначала кипятили в присутствии 1% SDS в течение 5 минут, а затем разбавляли 1:10 с использованием буфера для иммунопреципитации, содержащего 1 мг / мл BSA, с получением конечной концентрации 0,1% SDS. Лизаты центрифугировали при 15 800 г в течение 10 мин при 4 ° C, супернатанты инкубировали с 2 мкг анти-CAV1 (N20) в течение 1,5 ч при 4 ° C и иммунокомплексы осаждали с использованием протеина G-сефарозы. 500 мкг белка в 250 мкл или 1 мл конечного объема использовали для нативных или денатурирующих иммунопреципитатов соответственно.Иммунопреципитаты разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали вестерн-блоттингом.}

Иммунофлуоресцентная визуализация

Клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали с использованием 4% FA в PBS. Клетки были пермеабилизированы с использованием 0,05% сапонина и 1% BSA в PBS и инкубированы с соответствующими первичными (1: 500) и вторичными (1: 1000) антителами, а покровные стекла были помещены на предметные стекла с использованием Immumount (Thermo Fisher Scientific). Визуализацию проводили на системе инвертированного конфокального микроскопа (LSM 510 Meta; Carl Zeiss, Inc.) с объективом 100 × 1,4 NA.

FRAP

Для экспериментов с FRAP использовали либо необработанные клетки CV1-CAV1-mEGFP, либо клетки, обработанные 5 мкг / мл U18666A (16 ч), либо клетки CV1-GFP-GPI. Покровные стекла с клетками переносили в специальную камеру для покровных стекол металлического микроскопа в CO ₂ -независимой среде (Invitrogen) с добавлением 10% FCS. Анализ FRAP проводился при 37 ° C на системе инвертированного конфокального микроскопа (LSM 510 Meta), оснащенной предметным столиком с регулируемой температурой и 63 × 1.4 Цель НС. Определенная представляющая интерес область (4 × 4 мкм) была обесцвечена с использованием линии 488 нм 30 мВт Ar-лазера при высокой интенсивности лазера (100% мощность, 100% пропускание и 30 итераций), и восстановление флуоресценции регистрировалось с помощью сканирование при низкой интенсивности лазера (мощность 100% и пропускание 10%). Изображения были получены в виде 12-битных файлов LSM с разрешением 512 × 512 пикселей / кадр и боковым разрешением 0,14 мкм / пиксель. Серии изображений с небольшим или отсутствующим видимым движением ячеек были импортированы в ImageJ и автоматически выровнены с помощью плагина TurboReg (http: // bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/; Thévenaz et al., 1998). Среднюю интенсивность флуоресценции интересующей области определяли после вычитания фона и нормализации, как описано ранее (Phair and Misteli, 2000).

Флуоресцентная визуализация живых клеток

Клетки CV1, экспрессирующие конструкции с флуоресцентной меткой и высеянные на 18-миллиметровые покровные стекла, переносили в специальную камеру для покровного стекла для металлического микроскопа в CO ₂ -независимой среде (Invitrogen) с добавлением 10% FCS.Покадровую визуализацию TIR и эпифлуоресценцию выполняли на микроскопе (IX71; Olympus), оборудованном камерой (IMAGO QE; TILL Photonics), двойным конденсатором (TIR / EPI; TILL Photonics), лазером ArKr (Spectra Physics), акустооптическим настраиваемые фильтры (Optoelectronics, Inc.), полихромный источник монохроматического света IV (TILL Photonics), светоделитель с двойным обзором (Optical Insights) на пути испускаемого света, объектив с числовой апертурой 60 × 1,45 и инкубационная камера с регулируемой температурой , и с помощью программного обеспечения MetaMorph (MDS Analytical Technologies).Для TIR-освещения CAV1-mEGFP использовалась лазерная линия с длиной волны 488 нм, а глубина исчезающего поля регулировалась таким образом, чтобы освещались как вентральная клеточная поверхность, так и части комплекса Гольджи. Для эпииллюминации монохроматор использовался на 488 и 568 нм с разделителем луча на пути обнаружения света, чтобы избежать перекрестных помех между сигналами mEGFP и mCherry. Конфокальная визуализация живых клеток выполнялась на системе (LSM 510 Meta), оснащенной объективом 100 × 1,4 NA и столиком с регулируемой температурой.

Анализ колокализации

Изображения были получены от живых клеток, экспрессирующих CAV1-mCherry и EGFP-меченные эндосомные маркеры, с использованием вышеупомянутой системы (IX71; Olympus) с использованием монохроматического источника света (освещение EPI), объектива 60 × 1,45 NA и колесо фильтра на пути излучения света. Специально написанная процедура анализа, реализованная в MATLAB (MathWorks), использовалась для обнаружения эндосомных структур и определения перекрытия (Gupta et al., 2009). Всего было проанализировано около 6 × 10 ⁴ эндосом из n = 68 клеток для CAV1-mCherry / Rab5-EGFP, n = 68 клеток для CAV1-mCherry / Rab7-EGFP и n = 43 клеток. для CAV1-mCherry / Lamp1-EGFP.

Дополнительный материал онлайн

На фиг. S1 показаны уровни экспрессии CAV1-mRFP и CAV1-mEGFP, стабильно трансфицированных в клетках HeLa и CV1, соответственно, по сравнению с эндогенным CAV1. Оба слитых белка были эффективно включены в 8S / 70S-эквивалентные кавеолярные комплексы. Фиг. S1 также показывает, что накопление CAV1 в эндосомальных органеллах при сверхэкспрессии не может быть обращено ко-гиперэкспрессией cavin-1. Фиг. S2 иллюстрирует используемый метод автоматического анализа колокализации и показывает, как CAV1-mCherry в просвете LE / LYS, но не мембранный маркер LE / LYS Lamp1-EGFP, был потерян во время фиксации FA.Фиг. S3 описывает и характеризует нулевой по лизину мутант CAV1 (CAV1-K * R), показывая, что мутант эффективно включался в 8S / 70S-эквивалентные кавеолярные комплексы при экспрессии в клетках CV1 и достигал плазматической мембраны, где он локализуется в кавеолярных пятнах. На фиг. S3 также показаны иммунопреципитации CAV1, проведенные в денатурирующих условиях, подтверждая, что CAV1 убиквитинирован. Видео 1 показывает, что в клетках, предварительно обработанных U18666A, вновь синтезированный CAV1-mEGFP достиг плазматической мембраны в разобранном виде.Видео 2 показывает, что в LE / LYS просвет CAV1-mCherry был потерян вскоре после добавления фиксатора FA, тогда как Lamp1-EGFP в ограничивающих мембранах был должным образом зафиксирован. В видео 3 наша стратегия двойного тега использовалась для отслеживания нацеливания тандема CAV1 на кислый просвет отдельных созревающих эндосом. Дополнительные онлайн-материалы доступны по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.201003086/DC1.

Хэган, Томас [WorldCat Identities]

Наиболее распространенные произведения о Томас Хэган

Наиболее распространенные работы автора Томас Хэган

Уровень аудитории

Связанные предметы

Крышки

Альтернативные названия

Хэган, Том 1940-

Хайер, Талмадж

Хайер, Томас

Томас Хэган Американский убийца

Thomas Hagan US-amerikanischer Attentäter, ein Mörder von Malcolm X

תומאס הייגן

توماس اجان

ߕߐߡߊߛ ߤߍ߲ߜ߭ߊ߲߫ ߊߡߋߙߌߞߌ߬ ߡߐ߰ߝߊ߰ߟߊ߸ ߛߌ߬ߟߡߊ߬ߦߊ ߡߊ߲߬ߕߏ߲ ߛߌ߲߬ߝߏ߲߬ ߞߘߐ߸ ߊ߬ ߣߌ߫ ߡߐ߱ ߡߍ߲ ߞߊ߬ ߡߊߟߑߞߐߟߡ ߌߞߛ ߝߊ߰ ߁߉߆߅ ߟߊ߫

ト ー マ ス ・ ヘ イ ヤ ー

托馬斯 · 哈 甘

языков

Телевизоры, произведенные в США | Список брендов и производителей

Мы составили список U.S. производителей и брендов телевизоров, в том числе 3 компании, которые производят одни из лучших товаров для дома и улицы; Смарт-телевизоры с разрешением 720p, 1080p HD, 4K Ultra HD, водонепроницаемые туалетные столики и кухонные телевизоры, цифровые вывески и многое другое.

Хотя ни одна из этих компаний не производит свои телевизоры из компонентов, на 100% закупаемых в Америке, они все еще собирают их здесь, в США. Есть также несколько подробностей о производителях, а также партнерские ссылки на розничных продавцов, где вы можете получить последние цены, стоимость доставки, отзывы клиентов, специальные предложения и многое другое, если таковые имеются.

Зачем покупать продукцию американского производства? Каждое рабочее место на производстве создает в среднем 3-5 других рабочих мест (подробнее см. Ниже).

Каждое рабочее место на производстве в США создает в среднем 5 других хорошо оплачиваемых рабочих мест в Америке, таких как американское сырье и оборудование, менеджмент и канцелярская работа, складские работы, отгрузка и погрузочно-разгрузочные работы.Даже простая сборка создает дополнительные рабочие места.

Покупка продукции американского производства также способствует защите окружающей среды, поскольку производство в США создает меньше загрязнения, чем продукция, произведенная в зарубежных странах с меньшими требованиями.

Любые марки, отмеченные золотой звездой, указывают на то, что некоторые (или все) их продукты производятся в США с использованием 100% деталей местного производства. Серебряный значок указывает на то, что они собраны в Америке с использованием как отечественных, так и импортных материалов, а бронзовый значок указывает, что они собраны в США.С. использует все импортные материалы.

Суммарный рейтинг трех вышеуказанных телекомпаний составил 66,6% 100 «Сделано в Америке».